Trong giải trình tự thông lượng cao, xây dựng thư viện thông thường đòi hỏi phải khuếch đại PCR. Một mặt, nó là để khuếch đại các mẫu DNA vết và tăng năng suất thư viện. Mặt khác, nó có thể khuếch đại các tín hiệu huỳnh quang, giúp các máy giải trình tự dễ dàng bắt và nhận dạng các tín hiệu huỳnh quang hơn để cải thiện độ chính xác của giải trình tự. Tuy nhiên, PCR giống như một "con dao hai lưỡi". Trong khi giải quyết vấn đề về thể tích mẫu ban đầu thấp và khuếch đại tín hiệu huỳnh quang, nó cũng đưa vào các lỗi khuếch đại và sai lệch, và không thể trình bày hoàn hảo trình tự bộ gen "True face". Ngoài ra, PCR polymerase có một độ lệch khuếch đại nhất định. Một số vùng, đặc biệt là GC cao hoặc GC thấp, cấu trúc thứ cấp và các vùng khác, có hiệu suất khuếch đại thấp và khó bao phủ. Nó cũng sẽ đưa vào một số lượng lớn InDels sai và mang lại một số lượng lớn Sao chép. , gây lãng phí khối lượng dữ liệu DNA và làm tăng chi phí giải trình tự. Do đó, việc đưa vào công nghệ PCR-Free không chỉ có những ưu điểm của PCR mà còn khắc phục được những nhược điểm của PCR. Nó không chỉ có thể mang lại các thư viện chất lượng cao với độ nhạy cao và thực hiện phát hiện các mẫu vết mà còn có độ chính xác cao và giảm khối lượng công việc xác thực theo dõi cho các nghiên cứu biến thể. Vậy thư viện PCR-Free chính xác là gì và ưu điểm của nó là gì?

1. Thư viện PCR-Free là gì?
2. Ưu điểm của công nghệ PCR-Free là gì?
3. Hiển thị dữ liệu của PCR-Free
4. Câu hỏi thường gặp
5. Thông tin sản phẩm
6. Về việc đọc

1. Thư viện PCR-Free là gì?

Công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo là công nghệ được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu giải trình tự thông lượng cao trong sinh học phân tử hiện đại. Giải trình tự thế hệ đầu tiên truyền thống không còn có thể đáp ứng đầy đủ nhu cầu của các nhà nghiên cứu. Giải trình tự lại bộ gen của các sinh vật mô hình và giải trình tự bộ gen của các sinh vật không phải mô hình đòi hỏi nhiều chi phí hơn. Công nghệ giải trình tự thấp, thông lượng cao hơn, nhanh hơn, do đó đã tạo ra công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai. Nguyên tắc cốt lõi của công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai là giải trình tự bằng tổng hợp, nghĩa là xác định trình tự DNA bằng cách thu thập thông tin cơ sở được gắn nhãn cuối mới tổng hợp. Nguyên tắc chính của công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai để giải trình tự DNA là trước tiên phân mảnh DNA, sửa chữa phần cuối của DNA bị phân mảnh, sau đó thêm các bộ điều hợp cụ thể ở cả hai bên và sau đó sử dụng các phương pháp khác nhau để tạo ra hàng triệu PCR cố định về mặt không gian. Đối với mảng vô tính, dữ liệu giải trình tự được thu thập bằng cách sử dụng lai ghép mồi và phản ứng kéo dài bằng enzym để tạo ảnh các nhãn huỳnh quang được kết hợp bởi mỗi phản ứng kéo dài.

Giải trình tự DNA bằng giải trình tự thế hệ tiếp theo chủ yếu bao gồm hai quy trình: chuẩn bị thư viện và giải trình tự trên máy. Trong quá trình chuẩn bị thư viện, các đoạn gen bị ngắt quãng ngẫu nhiên thường được khuếch đại bằng PCR tiêu chuẩn. Tuy nhiên, đối với một số khuôn mẫu đặc biệt, có những yếu tố như cấu trúc thứ cấp phức tạp hoặc độ ổn định nhiệt kém, ảnh hưởng đến sở thích khuếch đại của PCR khuôn mẫu, do đó không phải tất cả các trình tự gen đều có thể được phản ánh như nhau trong thư viện khuếch đại PCR. Đặc biệt đối với một số khuôn mẫu có hàm lượng GC cao hoặc AT cao, đôi khi rất khó sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại để xây dựng thư viện. Không có sự khác biệt giữa thư viện không có PCR và thư viện PCR thông thường khi giải trình tự trên máy, ngoại trừ việc PCR không được thực hiện trong quá trình xây dựng thư viện. Về mặt lý thuyết, thư viện không có PCR có thể cải thiện sự phân bố của các lần đọc dữ liệu và tạo ra phạm vi bao phủ bộ gen đồng đều hơn.Thư viện không PCR là phần bổ sung cho phương pháp xây dựng thư viện. Vì được chuẩn bị trực tiếp vào thư viện trên bo mạch mà không cần khuếch đại PCR nên có thể cải thiện phạm vi bao phủ của một số vùng GC cao hoặc AT cao, do đó làm giảm các cơ sở lỗi do PCR, độ lệch dữ liệu và lặp lại trình tự.

Các bước cốt lõi của quá trình xây dựng thư viện NGS thông thường là phân mảnh bộ gen, sửa chữa đầu, bổ sung bộ điều hợp, PCR và khuếch đại tín hiệu trước khi giải trình tự. Vậy, xây dựng thư viện không cần PCR thì sao? Như tên gọi của nó, đây là quá trình xây dựng thư viện không yêu cầu PCR. Các bước cốt lõi của quá trình xây dựng thư viện là phân mảnh bộ gen, sửa đổi đầu, bổ sung liên kết và kiểm soát chất lượng thư viện. Nhưng trên thực tế, điều này chỉ có thể được coi là không cần PCR trong quá trình xây dựng thư viện. Quá trình không cần PCR thực sự phải là quá trình từ xây dựng thư viện đến giải trình tự mà không cần khuếch đại thư viện (chẳng hạn như công nghệ giải trình tự phân tử đơn) hoặc công nghệ giải trình tự mà không tích tụ lỗi khuếch đại PCR (chẳng hạn như DNBseq của MGI).

Hình 1. Sơ đồ dòng chảy của việc xây dựng thư viện thông thường và xây dựng thư viện không có PCR

2. Ưu điểm của công nghệ PCR-Free là gì?

Trong quá trình xây dựng thư viện thông thường, enzyme khuếch đại có thể đưa vào lỗi. Thông qua khuếch đại tuần hoàn, các lỗi này sẽ được tích lũy và khuếch đại, làm giảm độ trung thực của quá trình sao chép trình tự DNA. Ngoài ra, DNA polymerase cũng có độ lệch khuếch đại nhất định, đặc biệt đối với các vùng có sự khác biệt lớn về hàm lượng GC hoặc cấu trúc thứ cấp, dẫn đến hiệu quả khuếch đại thấp và độ đồng đều phủ sóng kém; trong khi đưa vào InDels sai, nó cũng sẽ mang lại một số lượng lớn Sao chép gây lãng phí khối lượng dữ liệu DNA và làm tăng chi phí giải trình tự. Công nghệ PCR-Free có thể tránh được các vấn đề nêu trên do khuếch đại PCR gây ra trong quá trình xây dựng thư viện thông thường. Trong quá trình xây dựng thư viện và giải trình tự, nếu có quá trình khuếch đại PCR, nó sẽ có tác động lớn hơn đến tính đồng nhất của độ phủ sóng bộ gen. Đối với các khuôn mẫu DNA, một số có cấu trúc thứ cấp phức tạp và một số có sự khác biệt lớn về độ ổn định nhiệt. Những yếu tố này sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại PCR. Do đó, trong quá trình khuếch đại PCR, không thể đảm bảo rằng tất cả các đoạn gen đều có thể đạt được hiệu suất khuếch đại như nhau, nhưng có một độ lệch khuếch đại rõ ràng, chẳng hạn như độ phủ thấp ở các vùng GC cao hoặc GC thấp của bộ gen. Tuy nhiên, không có PCR trong toàn bộ quá trình giải trình tự không dùng PCR. So với xây dựng thư viện PCR, độ phủ của các vùng GC cao và các vùng lặp lại AT/TA của bộ gen được cải thiện. Những lợi thế cụ thể như sau.

2.1 Quy trình chuẩn bị thư viện được sắp xếp hợp lý, tiết kiệm thời gian

Việc chuẩn bị thư viện không cần PCR giúp loại bỏ nhu cầu khuếch đại PCR và các bước khác, giúp đơn giản hóa quy trình chuẩn bị thư viện và tiết kiệm thời gian.

2.2 Giảm chi phí chuẩn bị thư viện

Trong quy trình chuẩn bị thư viện thông thường, các enzyme có độ trung thực cao đắt tiền được sử dụng để khuếch đại PCR để đảm bảo tính xác thực của trình tự. Đồng thời, PCR-Free loại bỏ bước khuếch đại PCR, giúp giảm chi phí chuẩn bị thư viện.

2.3 Giảm độ lệch khuếch đại

Enzym khuếch đại DNA có một số sai lệch khuếch đại nhất định, đặc biệt là đối với các khuôn mẫu có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng GC hoặc cấu trúc thứ cấp. Do đó, PCR-Free có thể tránh hiệu quả sai lệch khuếch đại do polymerase gây ra.

2.4 Không có sự trùng lặp PCR

PCR-Free có thể giảm số lần đọc trùng lặp và tăng tỷ lệ ánh xạ duy nhất cũng như hiệu quả sử dụng dữ liệu.

2.5 Giảm Sai Số

Quá trình khuếch đại PCR có nhiều khả năng gây ra lỗi sao chép của quá trình Chèn và Xóa, dẫn đến Tỷ lệ Lỗi của trình tự Indel cao hơn, trong khi PCR-Free có thể tránh hiệu quả việc tạo ra và tích tụ các lỗi như vậy.

3. Hiển thị dữ liệu của PCR-Free

Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện DNA miễn phí Hieff NGS™ Ultima Pro PCR V2 (Cat# 12196ES) có tỷ lệ chuyển đổi thư viện tốt hơn so với các sản phẩm cạnh tranh.

Hình 2. Số lượng dữ liệu giải trình tự ngoài máy để xây dựng thư viện PCR-Free

4. Câu hỏi thường gặp

H: Những loại mẫu nào phù hợp với thư viện không cần PCR?

A: Một số mẫu có cấu trúc thứ cấp phức tạp, GC cao và ưu tiên PCR có thể chọn thư viện không cần PCR để xây dựng.

H: Kích thước chung của thư viện không có PCR là bao nhiêu?

A: Bản thân thư viện PCR-free không có yêu cầu đặc biệt nào về kích thước đoạn. Thư viện sản phẩm PCR, thư viện được xây dựng theo kích thước của sản phẩm PCR. Đối với thư viện bộ gen, khuyến nghị là khoảng 350bp, do đó chất lượng dữ liệu thư viện tương đối tốt.

5. Thông tin sản phẩm

Sản phẩm mà Yeasen có thể cung cấp được thể hiện ở Bảng 1.

Bảng 1. Thông tin sản phẩm

6. Về việc đọc

Giải pháp chuẩn bị thư viện NGS từ mẫu DNA

Bạn biết bao nhiêu về công nghệ liên quan đến NGS?