Làm thế nào để chọn bộ điều hợp NGS?
NGS Adapter, một phần thiết yếu của thư viện giải trình tự thế hệ tiếp theo, đóng vai trò kết nối đoạn DNA đã thử nghiệm và tế bào Flow (chip giải trình tự). Hiệu quả của mối nối là một yếu tố quan trọng trong việc xác định chất lượng và năng suất của thư viện. Vậy NGS adapter là gì? Các loại NGS adapter phổ biến là gì? Và làm thế nào để chọn đúng NGS adapter cho nền tảng giải trình tự của bạn?
1. NGS Adapter là gì?
2. Bạn nên cân nhắc những yếu tố nào khi lựa chọn chỉ số NGS?
3. Có những loại chỉ mục phổ biến nào?
4. Có những loại bộ điều hợp NGS phổ biến nào?
- Bộ chuyển đổi UMI
- Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh
- Bộ chuyển đổi không đầy đủ
- Bộ chuyển đổi Tn5
5. Làm thế nào để chọn bộ điều hợp NGS phù hợp cho nền tảng giải trình tự của bạn?
6. Về Đọc
1. NGS Adapter là gì?
NGS Adapter, một loạt các bộ điều hợp trong giải trình tự, là một trình tự nucleotide ngắn với một trình tự đã biết. Nó được nối với cả hai đầu của đoạn axit nucleic mục tiêu. Trong quá trình giải trình tự, nó bắt đầu giải trình tự bằng cách lai với trình tự đã biết trên tế bào Flow để kết hợp thư viện với chip. Vậy cấu trúc của bộ điều hợp NGS là gì?
Lấy nền tảng Illumina làm ví dụ, bộ chuyển đổi NGS có thể được chia thành ba phần:
P5 và P7: Trình tự kết hợp với các đầu P5 và P7 trên tế bào Flow để cố định thư viện trên chip giải trình tự, tạo điều kiện cho phản ứng cụm thông qua Bridge-PCR.
Rd1 SP và Rd2 SP (mồi giải trình tự Read1/Read2): Vùng liên kết của mồi giải trình tự, chỉ ra vị trí mà trình tự bắt đầu được đọc.
Chỉ mục (còn gọi là mã vạch): một trình tự tổng hợp đã biết được sử dụng để phân biệt các mẫu khác nhau trong quá trình giải trình tự của thư viện hỗn hợp.
Quả sung. 1 Thư viện chỉ mục đơn của nền tảng Illumina
Quả sung. 2 Thư viện chỉ mục đầu cuối đơn của nền tảng MGI
Với sự gia tăng về thông lượng giải trình tự, nhiều mẫu có thể được giải trình tự cùng một lúc. Vì vậy, cách phân biệt các mẫu khác nhau đặc biệt quan trọng. Như đã đề cập trước đó, trình tự chỉ số của bộ điều hợp NGS được sử dụng để phân biệt các mẫu khác nhau trong giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS). Bạn nên cân nhắc những yếu tố nào khi chọn chỉ số? Vui lòng tiếp tục đọc...
2. Bạn nên cân nhắc những yếu tố nào khi chọn chỉ số?
Chỉ số thường có độ dài từ 6nt-18nt và được chia thành chỉ số đơn và chỉ số kép theo số lượng chỉ số. Chỉ số kép nằm ở cả hai đầu của mảnh cần kiểm tra. Cân bằng bazơ và cân bằng huỳnh quang nên được xem xét khi lựa chọn kết hợp chỉ số.
Cân bằng cơ sở đề cập đến sự cân bằng giữa nhiều chỉ số, thay vì sự cân bằng cơ sở trong một chỉ số duy nhất. Nó cần được xem xét từ cả hai loại cơ sở và phân phối cơ sở. Nguyên tắc kết hợp là cần đưa vào bốn cơ sở A/T/C/G trong cùng một nhóm chỉ số, tỷ lệ của bốn cơ sở này gần nhau, chiếm khoảng 25% tương ứng.
Cân bằng tín hiệu huỳnh quang đề cập đến lựa chọn đảm bảo cân bằng tín hiệu huỳnh quang khi không thể đảm bảo cân bằng cơ sở. Trong trình tự 4 kênh trong nền tảng Illumina, dG/dT được gắn nhãn huỳnh quang màu xanh lá cây và dC/dA được gắn nhãn huỳnh quang màu đỏ. Trong quá trình giải trình tự, cả tín hiệu huỳnh quang xanh và đỏ phải tồn tại trong mỗi chu kỳ để đảm bảo giải trình tự thành công. Do đó, cần cân nhắc đến sự cân bằng giữa tín hiệu xanh và tín hiệu đỏ khi lựa chọn chỉ số.
3. Có những loại chỉ mục phổ biến nào?
Các chỉ mục kép phổ biến thường bao gồm Chỉ mục kép duy nhất (UDI), Mã vạch kép duy nhất (UDB) và Chỉ mục kép kết hợp (CDI), giúp giảm đáng kể tình trạng nhảy chỉ mục và chỉ mục bị gán sai.
UDI&UDB: các chỉ mục ở cả hai đầu tương ứng một-một, được thiết kế theo nhóm và có thể được xác minh chéo ở cả hai đầu;
Bộ mồi UDI Stubby dành cho Illumina do
CDI: các chỉ mục ở cả hai đầu có thể được kết hợp theo các yêu cầu nhất định để tạo thành một thư viện chỉ mục hai đầu;
Một mồi CDI 384 cho Illumina, Set1-Set2 được cung cấp bởi
Để cải thiện hiệu suất thông lượng và khuếch đại cũng như giảm chi phí giải trình tự, Illumina đã giới thiệu công nghệ cụm tế bào dòng mảng (PFCT) và khuếch đại độc quyền (ExAmp) cho Novaseq và các máy giải trình tự thông lượng cao khác nhưng vô tình khuếch đại hiện tượng không khớp nhãn mẫu và nhảy chỉ mục.
Hình 3 Các mô hình dụng cụ khác nhau của Illumina sử dụng ô lưu lượng không có hoa văn hoặc ô lưu lượng có hoa văn
Để bù đắp cho vấn đề index hooping được nêu bật bởi các nền tảng giải trình tự như HiSeq3000/4000, HiSeq X Series và NovaSeq, Illumina đã đề xuất chiến lược đặt index ở cả hai đầu của thư viện, có thể thực hiện xác minh song phương và loại bỏ các bộ điều hợp không khớp. Khi sử dụng các index duy nhất ở cả hai đầu, tỷ lệ phân bổ lỗi index sẽ giảm xuống còn 0,01%. So với phương pháp kết hợp nhóm hoán vị index thông thường trước đây, index hopping sẽ giảm đi hai cấp độ.
Trong quá trình xây dựng thư viện không có PCR, có thể sử dụng bộ điều hợp chỉ mục một đầu. Sự không khớp nhãn chủ yếu là do lỗi giải trình tự. Nhìn chung, tỷ lệ không khớp nhãn thấp (trung bình 0,0004%, lên đến 0,001%). Tuy nhiên, trong quá trình xây dựng thư viện thu thập mục tiêu, vấn đề nhiễu xuyên âm được khuếch đại vì nhiều bước sẽ dẫn đến sự không khớp nhãn và bộ điều hợp UDI/UDB/CDI thường được sử dụng.
4. Có những loại bộ điều hợp NGS phổ biến nào?
Với sự phát triển của công nghệ giải trình tự, ngày càng có nhiều loại bộ điều hợp, chẳng hạn như bộ điều hợp chỉ số đơn/chỉ số kép (như đã đề cập ở phần 3), bộ điều hợp UMI, bộ điều hợp transposase, bộ điều hợp hoàn chỉnh/không hoàn chỉnh, v.v., phù hợp với nhiều tình huống ứng dụng khác nhau. Phần này sắp xếp có hệ thống các bộ điều hợp này để cung cấp cho bạn nền tảng lựa chọn bộ điều hợp.
4.1 Bộ chuyển đổi UMI
Bộ điều hợp nhận dạng phân tử duy nhất (UMI) là một công cụ tiên tiến để phát hiện đột biến tần số thấp và định lượng tuyệt đối. UMI là một trình tự tổng hợp ngẫu nhiên với trình tự đã biết. Nó có thể được thiết kế như một chuỗi nucleotide hoàn toàn ngẫu nhiên, chuỗi nucleotide thoái hóa một phần hoặc chuỗi nucleotide cố định.Chiều dài thường là 10nt (UMI một đầu) hoặc 5-8nt (UMI hai đầu). Chức năng của nó là đóng băng trạng thái của các đoạn DNA trước khi khuếch đại và mỗi phân tử DNA tương ứng với một UMI. Do đó, trong quá trình phân tích tin sinh học, nó có thể phân biệt các khuôn mẫu DNA từ các nguồn khác nhau, phân biệt đâu là đột biến dương tính giả do lỗi ngẫu nhiên trong quá trình khuếch đại và giải trình tự PCR và đâu là đột biến thực sự do bệnh nhân mang, để lọc nhiễu nền, thực hiện phát hiện chính xác các đột biến tần số thấp và tần số cực thấp và thực hiện định lượng tuyệt đối các phân tử DNA khác nhau. Nó được sử dụng rộng rãi trong phát hiện đột biến tần số thấp, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu khối u.
Hình 4 Sơ đồ bộ điều hợp UMI cấu trúc của nền tảng Illumina
4.2 Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh
Bộ điều hợp hoàn chỉnh, một sản phẩm cần thiết cho thư viện không có PCR, chứa tất cả các trình tự cần thiết cho giải trình tự, chẳng hạn như P5, P7, RdS1 và RdS2 trong nền tảng Illumina, cũng lập chỉ mục trình tự và trình tự UMI theo yêu cầu giải trình tự. Với bộ điều hợp hoàn chỉnh, có thể giải trình tự trực tiếp mà không cần đưa các bộ điều hợp khác vào thông qua PCR. Vì vậy, có thể sử dụng bộ điều hợp hoàn chỉnh để xây dựng thư viện không có PCR. Các thư viện không có PCR có thể giảm độ lệch khuếch đại PCR, tỷ lệ lỗi và trùng lặp trình tự, tăng phạm vi bao phủ của một số vùng GC cao hoặc AT cao được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu bộ gen quần thể.
Một sản phẩm bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho nền tảng Illumina được cung cấp bởi
Một sản phẩm bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho nền tảng MGI được cung cấp bởi
Hình 5 Sơ đồ bộ điều hợp hoàn chỉnh
4.3 Bộ điều hợp không đầy đủ
Bộ điều hợp không đầy đủ cần phải đưa các trình tự khác vào bằng PCR sau khi gắn bộ điều hợp để tạo thành bộ điều hợp hoàn chỉnh. Chúng được đặc trưng bởi hiệu quả kết nối cao và tỷ lệ thư viện hiệu quả cao. Quá trình PCR là hiệu ứng làm giàu cho thư viện hoàn chỉnh để đảm bảo nồng độ của thư viện hiệu quả và cũng có thể đưa các chỉ mục hai đầu và trình tự UMI.
4.4 Bộ chuyển đổi Tn5
Bộ điều hợp Tn5 kết nối một phần của trình tự bộ điều hợp với cả hai đầu của các đoạn DNA thông qua hoạt động của endonuclease hạn chế của Tn5. Chúng thực hiện phân mảnh và gắn bộ điều hợp đồng thời để tiết kiệm thời gian và mẫu. Cuối cùng, phần còn lại của trình tự liên kết, chỉ mục, UMI và các trình tự khác được đưa vào bằng PCR để tạo thành một thư viện hoàn chỉnh. Nó có thể được sử dụng để xây dựng thư viện Cut&tag.
Hình 6 Sơ đồ cấu trúc thư viện bộ điều hợp Tn5
5. Làm thế nào để chọn bộ điều hợp NGS phù hợp cho nền tảng giải trình tự của bạn?
Hiện nay, có hai nền tảng giải trình tự gen chính thống là Illumina và MGI.
Về mặt nền tảng Illumina, bộ điều hợp Illumina NGS được cung cấp bởi
Bộ chuyển đổi NGS hoàn chỉnh và UDI không cần lo lắng về vấn đề ghép nối, phù hợp với khách hàng muốn dễ sử dụng; Bộ chuyển đổi NGS CDI có ít ống hơn và kích thước nhỏ, phù hợp với khách hàng muốn dễ dàng cất giữ và mang theo. Không có PCR đòi hỏi phải sử dụng bộ chuyển đổi NGS hoàn chỉnh.
Đối với Illumina
| TrongTube | Hieff NGS® DChuẩn bị cho NA Lib 384 CDI Primer cho Illumina, Bộ 1 (8*12, chỉ số 96) | 12412ES |
| Hieff NGS® DChuẩn bị cho NA Lib 384 CDI Primer cho Illumina, Bộ 2 (8*12, chỉ số 96) | 12413ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer cho Illumina, Bộ 1 (chỉ mục 96) | 12414ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer cho Illumina, Bộ 1 (chỉ mục 96) | 12415ES | |
| Trong đĩa | Bộ mồi Hieff NGS® Stubby UDI cho Illumina (Chỉ số 1-384) Bộ 1-4 | 12407ES |
| Bộ mồi Hieff NGS® Stubby UDI cho Illumina Bộ 1（Tấm 96 giếng, Chỉ số 1-96) Bộ 1 | 12327ES | |
| Bộ mồi Hieff NGS® Stubby UDI cho Illumina Bộ 2（Tấm 96 giếng, Chỉ mục 97-192) Bộ 2 | 12328ES | |
| Bộ mồi Hieff NGS® Stubby UDI cho Illumina Bộ 3（Tấm 96 giếng, Chỉ mục 193-288) Bộ 3 | 12329ES | |
| Bộ mồi Hieff NGS® Stubby UDI cho Illumina Bộ 4（Tấm 96 giếng, Chỉ mục 289-384) Bộ 4 | 12330ES |
Đối với MGI
| Hieff NGS™ Bộ chuyển đổi UMI UDB kép cho MGI, Set1/Set2 | 96 các loại chỉ số | |
| Hieff NGS™ Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho MGI, Set1/Set2/Set3(Yêu cầu) | 13360ES | 8 các loại chỉ số, 41-48 |
| 13361ES | 16 các loại chỉ số, 57-72 | |
| 13362ES | 96 các loại chỉ số, 1-96 |
Về Đọc
Các enzyme chính tham gia vào quá trình xây dựng thư viện NGS
Bạn biết bao nhiêu về công nghệ liên quan đến NGS?
Các loại hạt từ tính khác nhau trong NGS: Hạt từ tính DNA\RNA\mRNA
Định lượng thư viện NGS: Qubit nhanh và chính xác hay qPCR chính xác? Tất cả đều cần thiết!