1. Năng suất bản sao thấp

Chất lượng của mẫu có liên quan chặt chẽ đến năng suất. Nếu năng suất của nhóm thử nghiệm thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, thì những lý do có thể là:

① mẫu thử nghiệm chứa các thành phần ức chế;

② Mẫu có lỗi.

Gợi ý:

① Làm sạch lại mẫu;

② Xác định số lượng mẫu và tính toàn vẹn của nó;

③ Kéo dài thời gian phản ứng;

④ Tăng lượng mẫu nhập vào;

⑤ Hãy thử các chất xúc tiến và RNA polymerase khác.

2. Năng suất thấp của bản sao ngắn

Một đoạn khởi đầu phiên mã ngắn sẽ ức chế phản ứng. Khi sản phẩm phiên mã nhỏ hơn 100 nt, kéo dài thời gian phản ứng lên 4-8 giờ hoặc tăng lượng khuôn mẫu lên 2 μg sẽ làm tăng sản lượng RNA.

3. Chiều dài phiên mã RNA dài hơn dự kiến

Nếu kết quả điện di cho thấy dải sản phẩm lớn hơn kích thước dự kiến ​​thì có thể có những lý do sau:

① Khuôn mẫu plasmid có thể không được tuyến tính hóa hoàn toàn;

②Đầu 3' của sợi cảm ứng có cấu trúc nổi bật;

③RNA có cấu trúc bậc 2 không bị biến tính hoàn toàn.

Gợi ý:

①Kiểm tra xem mẫu đã được tuyến tính hóa hoàn toàn chưa và nếu cần, hãy thực hiện tuyến tính hóa bổ sung;

②Chọn một enzyme hạn chế thích hợp để tránh phần nhô ra ở đầu 3' hoặc sử dụng DNA polymerase Klenow Fragment/T4 để hoàn tất quá trình phiên mã trước khi tiến hành;

③Sử dụng gel biến tính để phát hiện sản phẩm RNA.

4. Chiều dài phiên mã RNA ngắn hơn dự kiến

Nếu kết quả điện di cho thấy dải sản phẩm nhỏ hơn kích thước mong đợi thì có thể có những lý do sau:

① Khuôn mẫu chứa trình tự kết thúc tương tự như RNA polymerase T7;

②Hàm lượng GC trong mẫu cao.

Gợi ý:

①Giảm nhiệt độ phản ứng (ví dụ: 30°C). Đôi khi việc giảm nhiệt độ có thể làm tăng độ dài phiên mã, nhưng sẽ làm giảm năng suất. Hoặc thử các loại RNA polymerase khác nhau để phiên mã;

②Nếu hàm lượng GC mẫu cao thì sử dụng 42℃ để phiên mã hoặc thêm SSB để tăng sản lượng và độ dài phiên mã.

5. Điện di đuôi sản phẩm phiên mã

Có hiện tượng đuôi xuất hiện trong quá trình điện di.

Những lý do có thể:

①Bị nhiễm RNase trong quá trình vận hành thử nghiệm;

②Mẫu DNA bị nhiễm bẩn bởi RNase.

Gợi ý:

①Sử dụng đầu pipet không chứa RNase và ống EP, đeo găng tay cao su và khẩu trang dùng một lần, và tất cả thuốc thử đều được chuẩn bị bằng H2O không chứa RNase.

②Tái tinh chế DNA khuôn mẫu.

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, và cộng sự.Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) làm tăng khả năng gây bệnh của nấm bằng cách điều chỉnh biểu hiện gen BmPEX16 ở vật chủ của nó, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Định lượng siêu nhạy miR-195-5p tuần hoàn với chuỗi khuếch đại dịch chuyển ba sợi. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)