Hieff^™ Nhanh chóng di động trực tiếp Bộ RT-qPCR dựa trên thuốc nhuộm SYBR Green thích hợp để chiết xuất RNA từ tất cả các loại tế bào động vật (như tế bào thành dòng tế bào và tế bào huyền phù, tế bào nuôi cấy sơ cấp, các loại tế bào gốc, tế bào iPS, v.v.), mà không cần chiết xuất RNA và có thể được sử dụng trực tiếp để phân tích biểu hiện qPCR, ngắn gọn, dễ vận hành và có tỷ lệ lỗi thấp. Chỉ mất 1,5 giờ để hoàn thành các bước từ chuẩn bị khuôn mẫu đến phản ứng phiên mã ngược và phân tích biểu hiện gen.

Bộ dụng cụ có bao gồm thuốc thử phiên mã ngược và phát hiện huỳnh quang, có thể được sử dụng để phân tích biểu hiện gen mà không cần phải mua thêm thuốc thử.

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Kho

Đệm ly giải FCD và đệm rửa FCD được nấu chảy và bảo quản ở nhiệt độ 4°C để tránh nhiễm bẩn. Dung dịch dừng FCD、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃.

Hướng dẫn

1. Chuẩn bị sản phẩm phân cắt

1)1. Làm tan chảy thuốc thử ở nhiệt độ phòng, lật ngược và trộn nhẹ trước khi sử dụng, và sử dụng sau khi ly tâm nhẹ để tránh tạo bọt*.

*Không trộn đều thuốc thử, sử dụng máy dao động để trộn và không định hình thuốc thử trên đá có thể làm giảm hiệu suất của phản ứng.

2) Tùy thuộc vào loại tế bào**, chuyển tế bào vào ống ly tâm và ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 2 phút để thu thập tế bào và hút môi trường. Nếu tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng, môi trường có thể được hút trực tiếp.

​​​​​​​​3) Thêm 150 μL đệm rửa FCD vào mỗi giếng, rửa tế bào bằng cách thổi, ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 2 phút và hút đệm rửa FCD***.

​​​​​​​​4) Thêm 48 μL dung dịch đệm ly giải FCD và 2 μL dung dịch DNase Ⅰ vào mỗi giếng, thổi và trộn ở nhiệt độ phòng, sau đó để yên trong 5 phút, sau đó thêm 2.5 μL dung dịch dừng phản ứng FCD sau khi ủ****, sau đó thổi và trộn khoảng 5 lần để thu được sản phẩm cắt*****.

** Yêu cầu cơ bản về số lượng tế bào là 1 × 10⁴ tế bào trên mỗi giếng và bộ dụng cụ này có thể được sử dụng trong phạm vi 1 × 10³ - 1 × 10⁶ tế bào. nếu số lượng tế bào lớn hơn, lượng dung dịch đệm ly giải FCD và dung dịch DNaseⅠ có thể được tăng theo tỷ lệ thích hợp.

*** Điều kiện ly tâm khác nhau tùy theo từng tế bào, vì vậy hãy ly tâm ở tốc độ phù hợp với loại tế bào đang sử dụng.

**** Thêm 2,5 μL dung dịch dừng phản ứng FCD vào 50 μL dịch phân hủy và tăng lượng dung dịch dừng phản ứng FCD nếu cần.

***** Để bảo quản lâu dài các dung dịch sản phẩm ly giải tế bào, hãy bảo quản ở nhiệt độ -20°C.

5）Làm tan chảy 4 x Hifair™ FCD RT Mix ở nhiệt độ phòng và trộn đều, đảo nhẹ, cho vào đá và định hình hệ thống phản ứng theo bảng dưới đây:

*******Mức sử dụng khuyến cáo là 2-5 μL, cố gắng không vượt quá 45%.

1. Phiên mã ngược

Dùng pipet trộn nhẹ dung dịch phản ứng đã chuẩn bị ở trên và thực hiện phản ứng phiên mã ngược theo quy trình trong bảng dưới đây:

* Nhiệt độ phiên mã ngược được khuyến nghị là 55°C. Đối với các mẫu có hàm lượng GC cao hoặc các mẫu phức tạp, nhiệt độ phiên mã ngược có thể tăng lên 60°C. Sản phẩm phiên mã ngược có thể được sử dụng trực tiếp để phát hiện RT-qPCR hạ lưu. Để tránh hệ thống phiên mã ngược ức chế phản ứng qPCR và để có được giá trị Ct thích hợp (10-35), sản phẩm có thể được pha loãng 10-1000 lần rồi sử dụng. Nếu các thí nghiệm hạ lưu không được thực hiện trong thời gian ngắn, có thể bảo quản ở nhiệt độ -20℃.

1. PCR định lượng huỳnh quang

1）Phản ứng hệ thống cấu hình

Tỷ lệ sau đây được khuyến nghị để chuẩn bị dung dịch phản ứng (chuẩn bị trên đá).

*Không thêm quá 1/10 thể tích RT-qPCR của sản phẩm phiên mã ngược. Nồng độ khuôn mẫu cao dễ dẫn đến khuếch đại không đặc hiệu, pha loãng thích hợp 5-50 lần. Lượng khuôn mẫu khuyến nghị là 4 μL, cố gắng không vượt quá 6 μL. Khi hiệu suất phản ứng kém, nồng độ mồi có thể được điều chỉnh trong phạm vi 0,2-1,0 μmol/L.

2）Quy trình khuếch đại PCR định lượng huỳnh quang (phương pháp hai bước)

3）Quy trình khuếch đại nhanh cho PCR định lượng huỳnh quang (phương pháp hai bước)

* Nhiệt độ ủ/kéo dài và thời gian kéo dài cuối cùng có thể được điều chỉnh phù hợp theo yêu cầu thực nghiệm. Chương trình nhanh phù hợp với hầu hết các gen và chương trình chuẩn có thể được thử nghiệm cho từng gen cấu trúc thứ cấp phức tạp.

Ghi chú

1. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn.

Phiên bản EN20230908

Tài liệu:

Hướng dẫn sử dụng

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf