Sự miêu tả
Hieff NGSTM Bộ chuẩn bị thư viện DNA OnePot Pro V3 là bộ chuẩn bị thư viện dựa trên phân mảnh enzyme thế hệ mới được phát triển và thiết kế đặc biệt cho Ánh sáng Nền tảng giải trình tự &MGI. So với các phương pháp xây dựng thư viện truyền thống, sản phẩm này sử dụng các enzyme phân mảnh chất lượng cao, loại bỏ quy trình siêu âm cồng kềnh. Nó đơn giản hóa hoạt động bằng cách kết hợp các mô-đun phân mảnh và sửa chữa cuối thành một. Ngoài ra, các enzyme và đệm cho mô-đun gắn kết được trộn sẵn, giúp giảm đáng kể thời gian và chi phí xây dựng thư viện. Điều này làm cho nó phù hợp hơn cho việc xây dựng thư viện tự động. Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện này có tỷ lệ chuyển đổi thư viện tuyệt vời và có thể áp dụng cho các mẫu từ tất cả các loài động vật, thực vật, vi sinh vật phổ biến, v.v., cũng như các mẫu FFPE. Trên cơ sở bộ xây dựng thư viện thế hệ trước, sản phẩm này thể hiện hiệu quả phân mảnh cao hơn, sửa chữa cuối, gắn đuôi dA và gắn bộ chuyển đổi hơn so với các phiên bản trước. Enzym có độ trung thực cao cải thiện đáng kể tính đồng nhất và độ trung thực của quá trình khuếch đại.
Thông số kỹ thuật
| Số mèo | 12194ES08 / 12194ES24 / 12194ES96 |
| Kích cỡ | 8 T / 24 T / 96 T |
Thành phần
| Số thành phần | Tên | 12194ES08 | 12194ES24 | 12194ES96 |
| 12194-A | Bôi trơnTM Bộ đệm 3.0 | 80 μL | 240 μL | 960 μL |
| 12194-B | Bôi trơnTM Enzym 3.0 | 80 μL | 240 μL | 960 μL |
| 12194-C | Hỗn hợp sẵn sàng cho việc nối | 200 μL | 600 μL | 3×800 μL |
| 12194-D | 2× Bộ khuếch đại Ultima HF | 200 μL | 600 μL | 3×800 μL |
[Ghi chú]: Các thành phần của bộ dụng cụ tương thích với cả hai Ánh sáng &MGI nền tảng giải trình tự, nếu bộ chuyển đổi hoàn chỉnh đã được sử dụng, Hieff NGSTM Hỗn hợp mồi (
Kho
Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong 1 năm.
Ghi chú
1. Về hoạt động
1. Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần，vì sự an toàn của bạn.
2. Rã đông các thành phần ở nhiệt độ phòng. Sau khi rã đông, trộn đều bằng cách lắc, xoay ống một lúc và đặt chúng vào đá để sử dụng sau.
3. Khi chuẩn bị dung dịch phản ứng của từng bước, nên sử dụng pipet để trộn đều hoặc lắc nhẹ. Lắc mạnh có thể làm giảm lượng thư viện đầu ra.
4. Rất khuyến khích sử dụng đầu pipet có lọc để tránh nhiễm chéo. Đảm bảo thay đổi đầu pipet khi xử lý các mẫu khác nhau.
5. Các thao tác không đúng cách rất có thể gây ra ô nhiễm khí dung, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Khuyến cáo nên cách ly vật lý bắt buộc các vùng trộn phản ứng PCR và các vùng xét nghiệm tinh chế sản phẩm PCR. Được trang bị các thiết bị như pipet chuyên dụng để xây dựng thư viện. Thực hiện vệ sinh thường xuyên cho từng khu vực bằng cách lau bề mặt bằng 0,5% natri hypoclorit hoặc 10% thuốc tẩy
6. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Phân mảnh DNA
1. Bộ sản phẩm tương thích với 100 pg - 1000 ng DNA đầu vào. Rất khuyến khích sử dụng DNA đầu vào chất lượng cao với A260/A280 = 1,8-2,0.
2. Các thí nghiệm sau đây có thể bị ảnh hưởng nếu nồng độ muối cao như tác nhân tạo phức kim loại được đưa vào DNA đầu vào. Chúng tôi khuyên bạn nên rửa mẫu DNA trong ĐD2Ồ để phân mảnh.
3. Vui lòng tham khảo bảng 6 đối với thời gian phân mảnh của các mẫu DNA chuẩn. Bộ dụng cụ có độ lệch phân mảnh thấp và cung cấp phạm vi phủ GC đồng đều cho các mẫu DNA có nhiều thành phần GC. Vui lòng điều chỉnh thời gian phân mảnh dựa trên yêu cầu thử nghiệm của bạn.
4. Để phân mảnh chính xác, vui lòng chuẩn bị phản ứng trên đá.
3. Bộ chuyển đổi thắt chặt
1. Bộ chuyển đổi dài Illumina hoặc MGI (Bộ chuyển đổi mã vạch) và bộ chuyển đổi ngắn có sẵn để khách hàng lựa chọn theo yêu cầu thử nghiệm của mình.
2. Nên chọn bộ chuyển đổi thương mại chất lượng cao. Nếu chọn bộ chuyển đổi tự chế, vui lòng giao phó cho một công ty có kinh nghiệm trong tổng hợp mồi NGS và lưu ý nhu cầu kiểm soát ô nhiễm nghiêm ngặt. Ngoài ra, nên chuẩn bị dung dịch ủ DNA trong băng ghế sạch và chỉ vận hành một loại bộ chuyển đổi mỗi lần để tránh ô nhiễm chéo.
3. Vui lòng rã đông bộ chuyển đổi trên đá hoặc ở nhiệt độ 4°C; khi vận hành ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ phòng thí nghiệm không được vượt quá 25°C để tránh bộ chuyển đổi bị biến tính.
4. Chất lượng và nồng độ của bộ điều hợp sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả gắn kết và sản lượng thư viện. Nồng độ bộ điều hợp quá cao sẽ tạo điều kiện cho sự hình thành dimer bộ điều hợp trong khi quá ít bộ điều hợp sẽ làm giảm tốc độ gắn kết và sản lượng thư viện. Pha loãng tương ứng với đệm TE theo lượng DNA đầu vào khi sử dụng bộ điều hợp. Bảng 1-2 liệt kê các phương pháp pha loãng được khuyến nghị cho Bộ điều hợp thông thường và UMI cho các lượng DNA đầu vào khác nhau khi sử dụng bộ dụng cụ này cho nền tảng giải trình tự Illumina hoặc MGI.
Bàn 1 Illumina được đề xuất số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Ctỷ lệ pha loãng bộ chuyển đổi thông thường | Sự tập trung | Tỷ lệ pha loãng bộ chuyển đổi UMI | Sự tập trung |
| ＜1 ng | 7,5 lần | 2 μM | Gấp 15 lần | 1 μM |
| 1 ng ~ 10 ng | Gấp 3 lần | 5 μM | Gấp 3 lần | 5 μM |
| 10 ng ~ 200 ng | Gấp 1,5 lần | 10 μM | 2-Gấp | 7,5 μM |
| ＞200 ng | Gấp 0 | 15 μM | Gấp 0 | 15 μM |
Bàn 2 Đề nghị MGI số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Ctỷ lệ pha loãng bộ chuyển đổi thông thường | Sự tập trung | Tỷ lệ pha loãng bộ chuyển đổi UMI | Sự tập trung |
| ＜1 ng | 5-Gấp | 2 μM | Gấp 10 lần | 1 μM |
| 1 ng ~ 10 ng | 2-Gấp | 5 μM | 2-Gấp | 5 μM |
| 10 ng ~ 200 ng | Gấp 0 | 10 μM | 1.Gấp 25 lần | 8 μM |
| ＞200 ng | Gấp 0 | 10 μM | Gấp 0 | 10 μM |
4. Làm sạch DNA dựa trên hạt và lựa chọn kích thước
1. Việc lựa chọn kích thước DNA có thể được thực hiện trước khi sửa chữa đầu cuối/đuôi dA, sau khi thắt bộ tiếp hợp hoặc sau khi khuếch đại.
2. Nên thực hiện lựa chọn kích thước ngay sau khi thắt ống dẫn nếu lượng DNA đầu vào lớn hơn 50 ng; nếu không, vui lòng thực hiện chọn kích thước sau khi khuếch đại.
3. Chất tăng cường thắt có chứa nồng độ PEG cao, có thể gây ra tác động đáng kể đến việc lựa chọn kích thước chính xác. Do đó, nếu việc lựa chọn kích thước được thực hiện ngay sau khi thắt bộ chuyển đổi, chúng tôi khuyến nghị nên thêm bước làm sạch hạt trước khi lựa chọn kích thước. Bước lựa chọn kích thước có thể được thực hiện trực tiếp nếu được thực hiện trước khi sửa chữa cuối/dA-tailing hoặc sau sự khuếch đại của thư viện.
4. Các hạt từ tính phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng, nếu không năng suất sẽ giảm và hiệu quả lựa chọn kích thước sẽ bị ảnh hưởng.
5. Các hạt từ tính phải được trộn đều bằng cách dùng máy trộn xoáy hoặc hút bằng pipet trước khi sử dụng.
6. Không hút các hạt khi chuyển dịch chất lỏng nổi, ngay cả lượng nhỏ các hạt cũng có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sau.
7. Ethanol 80% phải được pha chế mới, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi.
8. Để lựa chọn kích thước chính xác, khuyến nghị bắt đầu với thể tích lớn hơn 100 μL. Nếu ít hơn, khuyến nghị tăng thể tích lên 100 μL bằng nước siêu tinh khiết.
9. Hạt từ tính nên được sấy khô ở nhiệt độ phòng trước khi rửa giải sản phẩm. Độ khô không đủ sẽ dễ khiến etanol còn lại ảnh hưởng đến các phản ứng tiếp theo; độ khô quá mức sẽ khiến hạt từ tính bị nứt và làm giảm hiệu suất tinh chế. Thông thường, sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút là đủ để hạt khô hoàn toàn.
10. Nếu cần, các mẫu DNA đã được tinh chế hoặc chọn kích thước sẽ được rửa giải trong 0,1× Đệm TE có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 tuần hoặc ở nhiệt độ -20°C trong một tháng.
5. khuếch đại thư viện
1. Việc có thực hiện khuếch đại thư viện hay không phụ thuộc vào lượng DNA đầu vào, loại bộ điều hợp, ứng dụng dữ liệu giải trình tự, v.v. Bước khuếch đại là bắt buộc nếu sử dụng bộ điều hợp một phần. Khi sử dụng bộ điều hợp toàn phần, nếu DNA đầu vào <200 ng, khuyến nghị thực hiện khuếch đại; nếu không, không cần khuếch đại.
2. Số chu kỳ khuếch đại phải được kiểm soát chặt chẽ. Khuếch đại không đủ có thể dẫn đến năng suất thư viện thấp; Khuếch đại quá mức có thể dẫn đến tăng độ lệch, lỗi, đọc trùng lặp và sản phẩm ghép. Bảng 3 liệt kê các số chu kỳ được khuyến nghị hướng tới mục tiêu đạt được sản lượng thư viện là 1 μg.
Bàn 3 Số chu kỳ được khuyến nghị để tạo ra 1.000 ng sản lượng thư viện
| Đầu vào DNA | Số chu kỳ cần thiết để tạo ra 1 μg thư viện |
| 1000-2000 ng | 2-4 |
| 500 ng | 2-4 |
| 250 ng | 4-6 |
| 100 ng | 5-7 |
| 50 ng | 7-9 |
| 10 ng | 9-11 |
| 5 ng | 10 - 12 |
| 1 ng | 12-15 |
| 100 trang | 16 - 18 |
Ghi chú
1. Bảng 3 hiển thị số lượng tham số vòng lặp sử dụng các xét nghiệm DNA đầu vào chất lượng cao khoảng 200 bp. Chất lượng DNA FFPE thay đổi rất nhiều và khi chất lượng DNA kém hoặc độ dài thư viện dài, số chu kỳ cần phải được tăng lên phù hợp để có đủ thư viện.
2. Nếu cần lựa chọn kích thước trong quá trình xây dựng thư viện, nên sử dụng số chu kỳ cao hơn cho Bộ khuếch đại thư viện; nếu không, nên sử dụng số chu kỳ thấp hơn.
3. Nếu sử dụng bộ chuyển đổi không đầy đủ, cần phải khuếch đại ít nhất 2 chu kỳ để tạo thành bộ chuyển đổi hoàn chỉnh.
6. Phân tích chất lượng thư viện
1. Chất lượng của các thư viện được xây dựng thường được phân tích bằng cách đo nồng độ và phân bố kích thước.
2. Nồng độ của thư viện có thể được đo bằng các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen hoặc qPCR.
3. KHÔNG khuyến khích sử dụng các phương pháp định lượng dựa trên độ hấp thụ như NanoDrop.
4. Nên sử dụng phương pháp qPCR để định lượng thư viện: các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen không thể phân biệt được các cấu trúc dsDNA không hoàn chỉnh (các đoạn chèn không có bộ chuyển đổi hoặc chỉ có một đầu được nối bằng bộ chuyển đổi) với các thư viện hoàn chỉnh. Phương pháp qPCR sẽ chỉ khuếch đại và đo các thư viện hoàn chỉnh với cả hai đầu được nối bằng bộ chuyển đổi (các thư viện có thể giải trình tự), do đó cung cấp phép đo chính xác hơn để tải.
5. Phân bố kích thước của thư viện có thể được phân tích bằng Agilent Bioanalyzer hoặc các thiết bị khác dựa trên nguyên tắc điện di mao quản hoặc vi lưu chất.
7. Vật liệu khác
1. Hạt từ tinh chế DNA: Hieff NGSTM Hạt lựa chọn DNA (
2.Bộ chuyển đổi: Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho Illumina:
3. Phân tích chất lượng thư viện: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip hoặc các sản phẩm tương đương khác; thuốc thử định lượng thư viện.
4. Các vật liệu khác: ethanol tuyệt đối, nước siêu tinh khiết vô trùng, đầu pipet lưu giữ thấp, ống PCR, giá đỡ từ tính, máy luân nhiệt, v.v.
8. Quy trình làm việc
Hình 1. Quy trình làm việc của Một nồi Chuyên nghiệp ADN Bộ dụng cụ chuẩn bị cho thư viện
Các con số
Kích thước của các mảnh chèn thu được trong các điều kiện phân mảnh khác nhau
Sử dụng 500 ng gDNA chuẩn làm khuôn mẫu, các thư viện được xây dựng bằng bộ dụng cụ này. Các điều kiện phân mảnh là tiêu hóa bằng enzym ở 32°C, 35°C và 37°C trong 5, 10, 15, 20 và 30 phút tương ứng. Các sản phẩm phân mảnh được tinh chế bằng hạt từ tính 1,2x và rửa giải bằng 21 μL ddH2O. Nồng độ được đo bằng Qubit và sự phân bố của các mảnh chèn thu hồi được thể hiện trong hình sau.
 |
Hình 2. Hồ sơ thư viện ở 32°C cho thời gian tiêu hóa enzyme khác nhau
 |
 |
Thanh toán & Bảo mật
Thông tin thanh toán của bạn được xử lý an toàn. Chúng tôi không lưu trữ chi tiết thẻ tín dụng cũng như không có quyền truy cập vào thông tin thẻ tín dụng của bạn.
Cuộc điều tra
Bạn cũng có thể thích
Câu hỏi thường gặp
Sản phẩm chỉ dành cho mục đích nghiên cứu và không dùng để điều trị hoặc chẩn đoán ở người hoặc động vật. Sản phẩm và nội dung được bảo vệ bởi các bằng sáng chế, nhãn hiệu và bản quyền thuộc sở hữu của
Một số ứng dụng có thể yêu cầu thêm quyền sở hữu trí tuệ của bên thứ ba.