Bộ dụng cụ chuẩn bị đồng thời thư viện DNA&RNA Hieff NGS® V2 là bộ thư viện đồng bộ DNA&RNA cho nền tảng giải trình tự Illumina®&MGI®, chứa thuốc thử tổng hợp cDNA hiệu quả và thuốc thử tiêu hóa enzyme. So với thư viện truyền thống sự thi công phương pháp, sản phẩm này có thể hoàn thành hiệu quả tổng hợp cDNA và thư viện DNA&RNA sự thi công trong một ống. Bộ dụng cụ chứa enzyme chất lượng cao để phân mảnh DNA và kết hợp phân mảnh DNA, sửa chữa đầu cuối và gắn đuôi dA thành một bước, giúp giảm đáng kể thời gian và chi phí chuẩn bị thư viện. Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện này có tỷ lệ chuyển đổi thư viện tuyệt vời và có thể áp dụng cho các mẫu từ tất cả các loài động vật, thực vật, vi sinh vật phổ biến, v.v., cũng như các mẫu FFPE. Bộ dụng cụ nâng cấp này sử dụng ligase được tối ưu hóa mới nhất làm giảm đáng kể tỷ lệ tự thắt trong quá trình thắt bộ điều hợp. Hơn nữa, việc giới thiệu một loại polymerase có độ trung thực cao mới giúp cải thiện thêm tính đồng nhất và độ trung thực của quá trình khuếch đại.

Tất cả các thành phần được cung cấp trong bộ sản phẩm đều trải qua quá trình kiểm soát chất lượng và xác minh chức năng nghiêm ngặt, đảm bảo tính ổn định và khả năng lặp lại của việc xây dựng thư viện ở mức độ cao nhất.

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Ghi chú: * chỉ ra rằng thuốc thử này không có trong bộ dụng cụ này và cần có thuốc thử bổ sung. Bộ dụng cụ là tương thích với nền tảng kép của Ánh sáng^®&MGI^®, nhưng hỗn hợp sơn lót bổ sung (CAT # 13334 Hỗn hợp sơn lót cho MGI^® và Cat# 13335 Primer Mix cho Illumina^®) là bắt buộc.

Quy trình làm việc:

Kho

Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong 1 năm.

Ghi chú

Về hoạt động

1. 1. Vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn.
2. Rã đông các thành phần ở nhiệt độ phòng.Sau khi rã đông, trộn đều bằng cách lắc, xoay ống một lúc và đặt chúng vào đá để sử dụng sau.
3. Nên thực hiện từng bước phản ứng trong máy chu trình nhiệt có nắp đậy được làm nóng. Máy chu trình nhiệt phải được làm nóng trước đến nhiệt độ đã đặt trước khi sử dụng.
4. Vui lòng sử dụng vật tư tiêu hao không có RNaseô nhiễm và vệ sinh khu vực thí nghiệm thường xuyên. RNAZap của ThermoFisher^TM Thuốc xịt loại bỏ axit nucleic hiệu quả cao được khuyến nghị để loại bỏ nhiễm bẩn RNase.
5. Thao tác không đúng cách rất có thể gây ra ô nhiễm khí dung, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả.Khuyến cáo nên cô lập vật lý bắt buộc các vùng trộn phản ứng PCR và vùng xét nghiệm tinh chế sản phẩm PCR. Được trang bị các thiết bị như pipet chuyên dụng để xây dựng thư viện.
6. 6. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.

Bộ chuyển đổi thắt chặt

1. Bộ chuyển đổi dài Illumina hoặc MGI (Bộ chuyển đổi mã vạch) và bộ chuyển đổi ngắn có sẵn để khách hàng lựa chọn theo yêu cầu thử nghiệm của mình.
2. Nên chọn bộ chuyển đổi thương mại chất lượng cao. Nếu chọn bộ chuyển đổi tự chế, vui lòng giao phó cho một công ty có kinh nghiệm trong tổng hợp mồi NGS và lưu ý nhu cầu kiểm soát ô nhiễm nghiêm ngặt. Ngoài ra, nên chuẩn bị dung dịch ủ DNA trong băng ghế sạch và chỉ vận hành một loại bộ chuyển đổi mỗi lần để tránh ô nhiễm chéo.
3. Vui lòng rã đông bộ chuyển đổi trên đá hoặc ở nhiệt độ 4°C; khi vận hành ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ phòng thí nghiệm không được vượt quá 25°C để tránh bộ chuyển đổi bị biến tính.
4. Nồng độ của bộ chuyển đổi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả gắn kết và năng suất thư viện. Thể tích bộ chuyển đổi được thêm vào bộ dụng cụ được cố định ở mức 5 μl. Bộ chuyển đổi được khuyến nghị pha loãng với đệm TE 0,1× và bộ chuyển đổi đã pha loãng có thể được bảo quản ở 4°C trong 48 giờ. Bảng1 liệt kê lượng bộ điều hợp được khuyến nghị cho các lượng RNA đầu vào khác nhau.

Bảng 1-1 Illumina được đề xuất^® số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN và ARN

Bảng 1-2 MGI được đề xuất^® số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN và ARN

*Có thể điều chỉnh cách sử dụng Bộ chuyển đổi tùy theo các loại mẫu RNA tổng số và lượng đầu vào khác nhau.

khuếch đại thư viện

Số chu kỳ khuếch đại phải được kiểm soát chặt chẽ. Khuếch đại không đủ có thể dẫn đến năng suất thư viện thấp; Khuếch đại quá mức có thể dẫn đến tăng độ lệch, lỗi, đọc trùng lặp và sản phẩm ghép. Bảng 2 liệt kê các số chu kỳ được khuyến nghị hướng tới mục tiêu đạt được sản lượng thư viện là 1 μg.

Bàn 2 Số chu kỳ được khuyến nghị để tạo thư viện DNA&RNA *

Lưu ý: *Sản lượng của thư viện không chỉ liên quan đến số lượng đầu vào và số chu kỳ khuếch đại mà còn bị ảnh hưởng bởi chất lượng mẫu, điều kiện phân mảnh và điều kiện phân loại. Trong quá trình xây dựng thư viện, hãy lựa chọn điều kiện phù hợp nhất theo tình hình thực tế.

Làm sạch DNA dựa trên hạt và lựa chọn kích thước

1. 1. Có nhiều bước trong quá trình xây dựng thư viện đòi hỏi hạt từ tính tinh chế DNA. Chúng tôi khuyên dùng Hạt chọn lọc DNA Hieff NGS™ (Yeasen Hạt từ tính Cat#12601) hoặc AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) để tinh chế DNA và lựa chọn kích thước.
2. 2. Hạt từ tính phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng, nếu không năng suất sẽ giảm và hiệu quả lựa chọn kích thước sẽ bị ảnh hưởng.
3. 3. Các hạt từ tính phải được trộn đều bằng cách dùng máy trộn xoáy hoặc hút bằng pipet trước khi sử dụng.
4. 4. Không hút hạt khi chuyển dịch trong, ngay cả lượng hạt rất nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sau.
5. 5. Ethanol 80% phải được pha chế mới, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi.
6. 6. Hạt từ tính phải được sấy khô ở nhiệt độ phòng trước khi rửa giải sản phẩm. Độ khô không đủ sẽ dễ khiến etanol còn lại ảnh hưởng đến các phản ứng tiếp theo; độ khô quá mức sẽ khiến hạt từ tính bị nứt và làm giảm hiệu suất tinh chế. Thông thường, sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút là đủ để hạt khô hoàn toàn.
7. 7. Nếu cần, các mẫu DNA đã được tinh chế hoặc chọn kích thước sẽ được rửa giải trong1× Đệm TE có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 tuần hoặc ở nhiệt độ -20°C trong một tháng.

Phân tích chất lượng thư viện

1. Chất lượng của các thư viện được xây dựng thường được phân tích bằng cách đo nồng độ và phân bố kích thước.
2. Nồng độ của thư viện có thể được đo bằng các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen hoặc qPCR.
3. KHÔNG khuyến khích sử dụng các phương pháp định lượng dựa trên độ hấp thụ như NanoDrop.
4. Nên sử dụng phương pháp qPCR để định lượng thư viện: các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen không thể phân biệt được các cấu trúc dsDNA không hoàn chỉnh (các đoạn chèn không có bộ chuyển đổi hoặc chỉ có một đầu được nối bằng bộ chuyển đổi) với các thư viện hoàn chỉnh. Phương pháp qPCR sẽ chỉ khuếch đại và đo các thư viện hoàn chỉnh với cả hai đầu được nối bằng bộ chuyển đổi (các thư viện có thể giải trình tự), do đó cung cấp phép đo chính xác hơn để tải.
5. Phân bố kích thước của các thư viện có thể được phân tích bằng Agilent Bioanalyzer hoặc các thiết bị khác dựa trên nguyên tắc điện di mao quản hoặc vi lưu chất.

Vật liệu khác

1. 1.Hạt từ tinh chế DNA: Hạt từ tính chọn lọc DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) hoặc AMPure^®Hạt XP (A63880) hoặc các sản phẩm tương đương khác.

2. Bộ chuyển đổi: Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 hoặc các sản phẩm tương đương khác) hoặc Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho MGI (Yeasen Cat#13360-13362 hoặc các sản phẩm tương đương khác).

3. Phân tích chất lượng thư viện: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip hoặc các sản phẩm tương đương khác; thuốc thử định lượng thư viện.
4. Các vật liệu khác: ethanol tuyệt đối, nước siêu tinh khiết vô trùng, đầu pipet lưu giữ thấp, ống PCR, giá đỡ từ tính, máy luân nhiệt, v.v.

Tài liệu:

Hướng dẫn sử dụng

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf