Sự miêu tả
Hieff NGSTM Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện RNA EvoMax (dUTP) là một đã trộn sẵn, actinomycine D miễn phí và sợi cụ thể tổng cộng Thư viện giải trình tự RNA chuẩn bị bộ sản phẩm tương thích với nền tảng Illumina và MGI. Sản phẩm này có hai loại: ống hoặc bộ dụng cụ niêm phong, và bộ dụng cụ này nhiều hơn thuận lợi cho dù bằng Thiết bị xử lý chất lỏng tự động hoặc thao tác thủ công Bộ dụng cụ này chứa các thuốc thử phân mảnh RNA, thuốc thử phiên mã ngược, thuốc thử tổng hợp ds-cDNA đặc hiệu từng sợi và thuốc thử khuếch đại thư viện. Nó có thể được liên kết với bộ dụng cụ tinh chế mRNA hoặc bộ dụng cụ loại bỏ rRNA để thực hiện nghiên cứu mRNA hoặc lncRNA. Sản phẩm này tối ưu hóa mô-đun phiên mã ngược để có được thư viện có độ đặc hiệu chuỗi cao mà không cần actinomycin D, đảm bảo an toàn cho người thử nghiệm ở mức độ lớn hơn. Tất cả các thuốc thử đều được kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt và xác nhận chức năng để tối đa hóa tính ổn định và khả năng lặp lại của thư viện sự chuẩn bị.
Thông số kỹ thuật
| Số mèo | 12340ES24/12340ES96/12340ES97/12340ES98 |
| Kích cỡ | 24 T / 96 T / 96 T (tự động hóa) / 96 T (tấm) |
Thành phần
| Số thành phần | Tên | 12340ES24 | 12340ES96 | 12340ES97 (tự động hóa) | 12340ES98 (Đĩa )** |
| 12340-A | Bộ đệm Frag/Prime | 450 μL | 2×900 μL | 2×1064 μL | 8×266 μL |
| 12340-B | Mô-đun phản ứng thứ nhất 2.0 | 192 μL | 768 μL | 960 μL | 8×120 μL |
| 12340-C | Mô-đun phản ứng thứ 2 (dUTP) | 840 μL | 3×1120 μL | 3×1280 μL | 8×480 μL |
| 12340-D | Mô-đun phản ứng liên kết | 840 μL | 3×1120 μL | 3×1280 μL | 8×480 μL |
| 12340-E | 2×Hỗn hợp độ trung thực cao Super Canace® II | 600 μL | 2×1200 μL | 2×1360 μL | 8×340 μL |
| * | Hỗn hợp sơn lót* | / | / | / | / |
Lưu ý: * Ký hiệu cho biết thành phần này không có trong bộ sản phẩm. Cần phải có hỗn hợp mồi nếu sử dụng bộ điều hợp hoàn chỉnh, nếu không thì không cần't. Bộ dụng cụ này tương thích với các nền tảng Illumina và MGI, nhưng cần thêm hỗn hợp sơn lót (Mã số # 13334 Hỗn hợp sơn lót cho MGITM và Cat # 13335 Primer Mix cho Illumina®) cho nền tảng Illumina® hoặc MGI nếu sử dụng bộ điều hợp hoàn chỉnh.
Nhân vật
Bố trí nhóm thuốc thử trên đĩa.
Hình 1: Bố trí thuốc thử của bộ thư viện tấm niêm phong
Hình 2. Các thành phần đơn giản của Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện RNA EvoMax.
Kho
Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong 1 năm.
Hướng dẫn
1. Lượng khuyến cáo để thêm vào hệ thống 20 μL là 0,1-1 đơn vị (U), và số lượng đầu vào có thể được điều chỉnh dựa trên kết quả thực tế.
2. Theo yêu cầu của thí nghiệm, nồng độ cuối cùng của dUTP có thể được điều chỉnh trong khoảng 0,2~0,6 mM và có thể thêm 0,2 mM dTTP một cách chọn lọc.
3. Thời gian phản ứng ở 25~37℃ có thể điều chỉnh trong vòng 5~10 phút theo yêu cầu thử nghiệm.
Ghi chú
1. Hoạt động
1) Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần，vì sự an toàn của bạn.
2) Rã đông các thành phần ở nhiệt độ phòng. Trộn đều bằng cách đảo ngược lên xuống nhiều lần, quay xuống một lúc và cho vào đá để sử dụng.
3) Nên thực hiện từng bước phản ứng trong máy chu trình nhiệt có nắp đậy được làm nóng. Máy chu trình nhiệt phải được làm nóng trước đến nhiệt độ đã đặt trước khi sử dụng.
4) Cần cung cấp vật tư không bị nhiễm RNase và vệ sinh khu vực thí nghiệm thường xuyên. RNAZap của ThermoFisherTM Thuốc xịt loại bỏ axit nucleic hiệu quả cao được khuyến nghị để loại bỏ nhiễm bẩn RNase.
5) Các thao tác không đúng cách rất có thể gây ra ô nhiễm khí dung, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Khuyến cáo nên cô lập vật lý bắt buộc các vùng trộn phản ứng PCR và vùng xét nghiệm tinh chế sản phẩm PCR. Được trang bị các thiết bị như pipet chuyên dụng phục vụ cho việc xây dựng thư viện.
6) Thuốc thử này chỉ dùng một lần. Nghiêm cấm sử dụng nhiều lần.
7) Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Thắt ống dẫn
1) Bộ chuyển đổi dài Illumina hoặc MGI (Bộ chuyển đổi mã vạch) và bộ chuyển đổi ngắn có sẵn để khách hàng lựa chọn theo yêu cầu thử nghiệm của mình.
2) Nên chọn bộ chuyển đổi thương mại chất lượng cao. Nếu chọn bộ chuyển đổi tự chế, vui lòng giao phó cho một công ty có kinh nghiệm trong tổng hợp mồi NGS và lưu ý nhu cầu kiểm soát ô nhiễm nghiêm ngặt. Ngoài ra, nên chuẩn bị dung dịch ủ DNA trong băng ghế sạch và chỉ vận hành một loại bộ chuyển đổi mỗi lần để tránh ô nhiễm chéo.
3) Vui lòng rã đông bộ chuyển đổi trên đá hoặc ở nhiệt độ 4°C; khi vận hành ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ phòng thí nghiệm không được vượt quá 25°C để tránh bộ chuyển đổi bị biến tính.
4) Nồng độ của bộ điều hợp ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả gắn kết và sản lượng thư viện. Thể tích bộ chuyển đổi được thêm vào bộ dụng cụ được cố định ở mức 5 μl. Các bộ chuyển đổi được khuyến nghị pha loãng với đệm TE 0,1× và các bộ chuyển đổi đã pha loãng có thể được bảo quản ở 4°C trong 48 giờ. Bảng 1 liệt kê lượng bộ điều hợp được khuyến nghị cho các lượng RNA đầu vào khác nhau.
Bảng 1-1 Lượng bộ điều hợp Illumina được khuyến nghị cho các RNA đầu vào khác nhau
| Tổng RNA đầu vào | Nồng độ kho Illumina® Adapter |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥1 μg | 5 μM |
Bảng 1-2 Lượng bộ điều hợp MGI được khuyến nghị cho RNA đầu vào khác nhau
| Tổng RNA đầu vào | Nồng độ kho dự trữ MGI® Adapter |
| 10~99 ng | 1 μM |
| 100~499 ng | 2 μM |
| 500~4000ng | 5 μM |
* Có thể điều chỉnh việc sử dụng bộ điều hợp theo các loại mẫu RNA tổng số khác nhau và lượng đầu vào
3.khuếch đại thư viện
1) Trên cơ sở DNA polymerase thế hệ đầu tiên, DNA polymerase có độ trung thực cao trong bộ dụng cụ đã cải thiện đáng kể tính đồng nhất khuếch đại và không có hiện tượng sai lệch khuếch đại.
2) Số chu kỳ khuếch đại phải được kiểm soát chặt chẽ. Khuếch đại không đủ có thể dẫn đến năng suất thư viện thấp; Khuếch đại quá mức có thể dẫn đến tăng độ lệch, lỗi, đọc trùng lặp, sản phẩm ghép và tích tụ đột biến mở rộng. Bảng 2 liệt kê số chu kỳ được khuyến nghị cho phản ứng khuếch đại PCR.
3) Số chu kỳ được khuyến nghị trong Bảng 2 có thể đáp ứng phần lớn các yêu cầu chuẩn bị thư viện. Nếu mẫu của bạn có chất lượng kém (như mẫu FFPE bị thoái hóa nghiêm trọng), số chu kỳ có thể được tăng lên một cách thích hợp, tùy theo tình hình thực tế. Lưu ý rằng mRNA khác nhau tùy theo loài và mô, nên cần điều chỉnh số chu kỳ khuếch đại.
Bảng 2 Tổng thể tích RNA đầu vào và chu kỳ khuếch đại được khuyến nghị Bảng *
| Tổng RNA đầu vào | Số chu kỳ |
| 10 ng | 16 |
| 100 ng | 14 |
| 500 ng | 12 |
| 1 μg | 11 |
[Lưu ý]: *Sản lượng của thư viện không chỉ liên quan đến số lượng đầu vào và số chu kỳ khuếch đại mà còn bị ảnh hưởng bởi chất lượng mẫu, điều kiện phân mảnh và điều kiện phân loại. Trong quá trình xây dựng thư viện, hãy lựa chọn điều kiện phù hợp nhất theo tình hình thực tế.
4. Làm sạch DNA dựa trên hạt và lựa chọn kích thước
1) Có nhiều bước trong quá trình xây dựng thư viện đòi hỏi hạt từ tính tinh chế DNA. Chúng tôi khuyên dùng Hạt từ tính chọn lọc DNA Hieff NGS™ (
2) Hạt từ tính phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng, nếu không năng suất sẽ giảm và hiệu quả lựa chọn kích thước sẽ bị ảnh hưởng.
3) Các hạt từ tính phải được trộn đều bằng cách dùng máy trộn xoáy hoặc hút bằng pipet trước khi sử dụng.
4) Không hút các hạt khi chuyển dịch chất lỏng nổi, ngay cả lượng nhỏ các hạt cũng có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sau.
5) Ethanol 80% phải được pha chế mới, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi.
6) Hạt từ tính nên được sấy khô ở nhiệt độ phòng trước khi rửa giải sản phẩm. Độ khô không đủ sẽ dễ khiến etanol còn lại ảnh hưởng đến các phản ứng tiếp theo; độ khô quá mức sẽ khiến hạt từ tính bị nứt và làm giảm hiệu suất tinh chế. Thông thường, sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút là đủ để hạt khô hoàn toàn.
7) Nếu cần, các mẫu DNA đã được tinh chế hoặc chọn kích thước phù hợp được rửa giải trong đệm TE có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 tuần hoặc ở nhiệt độ -20°C trong một tháng.
5.Phân tích chất lượng thư viện
Nhìn chung, chất lượng của thư viện được xây dựng có thể được đánh giá bằng cách phát hiện nồng độ và phát hiện phân bố độ dài.
6. Vật liệu khác
1) Bộ làm giàu mRNA: Bộ làm giàu mRNA Hieff NGS® V2 (
2) Bộ dụng cụ loại bỏ rRNA: Bộ dụng cụ loại bỏ rRNA của người Hieff NGS® MaxUp (rRNA & ITS / ETS) (
3) Tinh chế RNA của hạt từ tính: Hieff NGS® RNA Cleaner (
4) Hạt từ tinh khiết DNA: Hạt chọn lọc DNA Hieff NGS® (
5) Kiểm soát chất lượng RNA: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip hoặc các sản phẩm tương đương khác.
6) Bộ chuyển đổi: Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh để sử dụng Illumina® (Mã số # 13519-13520 hoặc tương đương) hoặc Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh để sử dụng MGI® (Mã số # 13360-13362 hoặc tương đương).
7. Kiểm tra chất lượng thư viện
Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / Chip độ nhạy cao hoặc các sản phẩm tương đương khác; thuốc thử định lượng thư viện.
8. Các vật liệu khác
Ethanol khan, nước siêu tinh khiết vô trùng, đầu súng hấp phụ thấp, ống PCR, khung từ, dụng cụ PCR, v.v.
Biểu đồ luồng
Hình 1: Quá trình xây dựng thư viện RNA
Chuẩn bị thư viện RNA cho các mẫu FFPE chất lượng khác nhau
Đối với RNA FFPE bị phân hủy nghiêm trọng (DV 200 <50%) và mẫu đầu vào thấp, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng giao thức tinh chế kép sau khi gắn bộ điều hợp để giảm mất thư viện.
Các mẫu đỉnh của các mẫu FFPE chất lượng khác nhau
Thanh toán & Bảo mật
Thông tin thanh toán của bạn được xử lý an toàn. Chúng tôi không lưu trữ chi tiết thẻ tín dụng cũng như không có quyền truy cập vào thông tin thẻ tín dụng của bạn.
Cuộc điều tra
Bạn cũng có thể thích
Câu hỏi thường gặp
Sản phẩm chỉ dành cho mục đích nghiên cứu và không dùng để điều trị hoặc chẩn đoán ở người hoặc động vật. Sản phẩm và nội dung được bảo vệ bởi các bằng sáng chế, nhãn hiệu và bản quyền thuộc sở hữu của
Một số ứng dụng có thể yêu cầu thêm quyền sở hữu trí tuệ của bên thứ ba.