Sự miêu tả
Hieff NGSTM Bộ công cụ chuẩn bị thư viện DNA là bộ công cụ xây dựng thư viện thế hệ mới được phát triển và thiết kế đặc biệt cho Ánh sáng® &MGI® nền tảng giải trình tự. Dựa trên thế hệ bộ dụng cụ xây dựng thư viện trước, sản phẩm này thể hiện hiệu quả cao hơn trong việc sửa chữa đầu, gắn đuôi dA và gắn bộ chuyển đổi so với các phiên bản trước. Enzym có độ trung thực cao cải thiện đáng kể tính đồng nhất và độ trung thực của quá trình khuếch đại. Bộ dụng cụ tương thích với hầu hết các loại mẫu DNA, bao gồm DNA bộ gen chuẩn từ động vật/thực vật/vi sinh vật, mẫu FFPE, cfDNA và DNA ChIP.
Thông số kỹ thuật
| Mèo.Nôi. | 12927ES08 / 12927ES24 / 12927Tiếng Việt96 |
| Kích cỡ | 8 rxn / 24 rxn / 96 rxn |
Thành phần
| Số thành phần | Tên | 12927ES08 | 12927ES24 | 12927ES96 |
| 12927-MỘT | 56 μL | 168 μL | 672 μL | |
| 12927-B | Enzym Endprep | 24 μL | 72 μL | 288 μL |
| 12927-C | Tăng cường thắt chặt | 240 μL | 720 μL | 3×960 μL |
| 12927-Đ | Nhanh T4 DNA Ligase | 80 μL | 240 μL | 2×480 μL |
| 12927-E | CanaceTM Bản phối khuếch đại chuyên nghiệp | 200 μL | 600 μL | 3×800 μL |
Kho
Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong 1 năm.
Ghi chú
1. Về hoạt động
1. Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn.
2. Rã đông các thành phần ở nhiệt độ phòng. Sau khi rã đông, trộn đều bằng cách lắc, quay ống một lúc và đặt chúng vào đá để sử dụng sau.
3. Khi chuẩn bị dung dịch phản ứng của từng bước, nên sử dụng pipet để trộn đều hoặc lắc nhẹ. Lắc mạnh có thể làm giảm lượng thư viện đầu ra.
4. Rất khuyến khích sử dụng đầu pipet có lọc để tránh nhiễm chéo. Đảm bảo thay đổi đầu pipet khi xử lý các mẫu khác nhau.
5. Các thao tác không đúng cách rất có thể gây ra ô nhiễm khí dung, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Khuyến cáo nên cô lập vật lý bắt buộc các vùng trộn phản ứng PCR và các vùng xét nghiệm tinh chế sản phẩm PCR. Được trang bị các thiết bị như pipet chuyên dụng để xây dựng thư viện.Thực hiện vệ sinh thường xuyên cho từng khu vực bằng cách lau bề mặt bằng 0,5% natri hypoclorit hoặc 10% thuốc tẩy
6. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Phân mảnh DNA
1. Bộ dụng cụ này tương thích với cả DNA bị phân mảnh bằng cơ học hoặc DNA bị phân mảnh bằng enzym.
2. Bộ dụng cụ tương thích với 100 pg - 1000 ng DNA đầu vào. Rất khuyến khích sử dụng DNA đầu vào chất lượng cao với A260/A280 = 1,8-2,0. Bảng 1 liệt kê lượng DNA đầu vào được khuyến nghị.
Bảng 1 Lượng DNA đầu vào được khuyến nghị
| Ứng dụng | Các loại mẫu | Đầu vào DNA |
| WGS | Bộ gen phức tạp | 50 ng-1000 ng |
| Trình tự chụp mục tiêu | Bộ gen phức tạp | 10 ng-1000 ng |
| WGS, Giải trình tự mục tiêu | ADN FFPE | 50 ng-1000 ng |
| Trình tự mục tiêu | cfDNA/ctDNA | ≥500 trang |
| WGS | bộ gen vi khuẩn | ≥1 ng |
| WGS (không có PCR) | DNA đầu vào chất lượng cao | ≥50 ng |
Ghi chú:Khi DNA đầu vào có chất lượng kém hoặc cần lựa chọn kích thước DNA, lượng DNA đầu vào cần phải tăng lên tương ứng.
3.“DNA đầu vào” cụ thể đề cập đến các mẫu DNA sẵn sàng để sửa chữa cuối cùng/cắt đuôi dA.
4. Bước tinh chế hạt/lựa chọn kích thước được khuyến nghị sau khi phân mảnh nếu mẫu DNA đầu vào chứa nồng độ muối cao như tác nhân tạo phức kim loại. Muối có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của các phản ứng sau, bao gồm sửa chữa đầu và tạo đuôi dA. Vui lòng rửa giải các mẫu DNA trong đệm TE thay vì nước siêu tinh khiết đã khử trùng để phân mảnh nếu sử dụng phương pháp phân mảnh cơ học. Nếu sử dụng phương pháp phân mảnh bằng enzym mà không thực hiện làm sạch hạt hoặc lựa chọn kích thước trước khi tiến hành chuẩn bị thư viện, vui lòng đảm bảo rằng đệm dừng được sử dụng không chứa quá nhiều tác nhân tạo phức kim loại. Nếu không, vui lòng làm sạch hoặc lựa chọn kích thước các mẫu đã phân mảnh và rửa giải chúng trong đệm TE hoặc nước siêu tinh khiết đã khử trùng (≤50 μL) trước khi tiến hành chuẩn bị thư viện.
3. Bộ chuyển đổi thắt chặt
1. Bộ chuyển đổi dài Illumina hoặc MGI (Bộ chuyển đổi mã vạch) và bộ chuyển đổi ngắn có sẵn để khách hàng lựa chọn theo yêu cầu thử nghiệm của mình.
2. Nên chọn bộ chuyển đổi thương mại chất lượng cao. Nếu chọn bộ chuyển đổi tự chế, vui lòng giao phó cho một công ty có kinh nghiệm trong tổng hợp mồi NGS và lưu ý nhu cầu kiểm soát ô nhiễm nghiêm ngặt. Ngoài ra, nên chuẩn bị dung dịch ủ DNA trong băng ghế sạch và chỉ vận hành một loại bộ chuyển đổi mỗi lần để tránh ô nhiễm chéo.
3. Vui lòng rã đông bộ chuyển đổi trên đá hoặc ở nhiệt độ 4°C; khi vận hành ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ phòng thí nghiệm không được vượt quá 25°C để tránh bộ chuyển đổi bị biến tính.
4. Chất lượng và nồng độ của bộ điều hợp sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả gắn kết và sản lượng thư viện. Nồng độ bộ điều hợp quá cao sẽ tạo điều kiện cho sự hình thành dimer bộ điều hợp trong khi quá ít bộ điều hợp sẽ làm giảm tốc độ gắn kết và sản lượng thư viện. Pha loãng tương ứng với đệm TE theo lượng DNA đầu vào khi sử dụng bộ điều hợp. Bảng 2 -5 liệt kê các phương pháp pha loãng Bộ chuyển đổi được khuyến nghị cho các lượng DNA đầu vào khác nhau khi sử dụng bộ dụng cụ này.
Bàn 2 Illumina được đề xuấtTM số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Pha loãng bộ chuyển đổi (Thể tích bộ chuyển đổi: Tổng thể tích) | Sự tập trung |
| 0,1ng ~ 1ng | Gấp 150 lần (1 : 150) | 0,1 μM |
| 1 ng ~ 10 ng | Gấp 75 lần (1 : 75) | 0,2 μM |
| 10 ng ~ 25 ng | Gấp 15 lần (1 : 15) | 1 μM |
| 25ng ~ 100ng | 7,5-Gấp (1 : 7.5) | 2 μM |
| 100 ng ~ 1000 ng | 3-Gấp (1 : 3) | 5 μM |
Bàn 3 MGI được đề xuấtTM số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Pha loãng bộ chuyển đổi (Thể tích bộ chuyển đổi: Tổng thể tích) | Sự tập trung |
| 0,1ng ~ 1ng | 10Gấp 0 (1 : 100) | 0,1 μM |
| 1 ng ~ 10 ng | 50-Gấp (1 : 50) | 0.2 μM |
| 10 ng ~ 25 ng | 10-Gấp (1 : 10) | 1 μM |
| 25ng ~ 100ng | 5-Gấp (1 : 5) | 2 μM |
| 100 ng ~ 1000 ng | 2-Gấp (1 : 2) | 5 μM |
Bàn 4 Illumina được đề xuấtTM UMI số lượng bộ chuyển đổi cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Pha loãng bộ chuyển đổi (Thể tích bộ chuyển đổi: Tổng thể tích) | Sự tập trung |
| 0,1ng ~ 1ng | Gấp 150 lần (1 : 150) | 0,1 μM |
| 1 ng ~ 10 ng | Gấp 75 lần (1 : 75) | 0,2 μM |
| 10 ng ~ 25 ng | Gấp 15 lần (1 : 15) | 1 μM |
| 25ng ~ 100ng | 7,5-Gấp (1 : 7.5) | 2 μM |
| 100 ng ~ 1000 ng | 3-Gấp (1 : 3) | 5 μM |
Bàn 5 MGI được đề xuấtTM UMI bộ chuyển đổi atôiđếm cho đầu vào khác nhau ADN
| Đầu vào ADN | Pha loãng bộ chuyển đổi (Thể tích bộ chuyển đổi: Tổng thể tích) | Sự tập trung |
| 5 ng ~ 25 Ng | 5Gấp 0 (1 : 50) | 0.2 μM |
| 25ng ~ 100ng | 10-Gấp (1 : 10) | 1 μM |
| 100 ng ~ 1000 ng | 4-Gấp (1 : 4) | 2.5 μM |
4. Làm sạch DNA dựa trên hạt và lựa chọn kích thước
1. Việc lựa chọn kích thước DNA có thể được thực hiện trước khi sửa chữa đầu cuối/đuôi dA, sau khi thắt bộ tiếp hợp hoặc sau khi khuếch đại.
2. Nên thực hiện lựa chọn kích thước ngay sau khi thắt bộ chuyển đổi nếu lượng DNA đầu vào lớn hơn 50 ng; nếu không, vui lòng thực hiện chọn kích thước sau khi khuếch đại.
3. Chất tăng cường thắt có chứa nồng độ PEG cao, có thể gây ra tác động đáng kể đến việc lựa chọn kích thước chính xác. Do đó, nếu việc lựa chọn kích thước được thực hiện ngay sau khi thắt bộ chuyển đổi, chúng tôi khuyến nghị nên thêm bước làm sạch hạt trước khi lựa chọn kích thước. Bước lựa chọn kích thước có thể được thực hiện trực tiếp nếu được thực hiện trước khi sửa chữa cuối/dA-tailing hoặc sau sự khuếch đại của thư viện.
4. Các hạt từ tính phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng, nếu không năng suất sẽ giảm và hiệu quả lựa chọn kích thước sẽ bị ảnh hưởng.
5. Các hạt từ tính phải được trộn đều bằng cách dùng máy trộn xoáy hoặc hút bằng pipet trước khi sử dụng.
6. Không hút các hạt khi chuyển dịch chất lỏng nổi, ngay cả lượng nhỏ các hạt cũng có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sau.
7. Ethanol 80% phải được pha chế mới, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi.
8. Để lựa chọn kích thước chính xác, khuyến nghị bắt đầu với thể tích lớn hơn 100 μL. Nếu ít hơn, khuyến nghị tăng thể tích lên 100 μL bằng nước siêu tinh khiết.
9. Hạt từ tính nên được sấy khô ở nhiệt độ phòng trước khi rửa giải sản phẩm. Độ khô không đủ sẽ dễ khiến etanol còn lại ảnh hưởng đến các phản ứng tiếp theo; độ khô quá mức sẽ khiến hạt từ tính bị nứt và làm giảm hiệu suất tinh chế. Thông thường, sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút là đủ để hạt khô hoàn toàn.
10. Nếu cần, các mẫu DNA đã được tinh chế hoặc chọn kích thước sẽ được rửa giải trong 0,1× Đệm TE có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 tuần hoặc ở nhiệt độ -20°C trong một tháng.
5. khuếch đại thư viện
1. Việc có thực hiện khuếch đại thư viện hay không phụ thuộc vào lượng DNA đầu vào, loại bộ điều hợp, ứng dụng dữ liệu giải trình tự, v.v. Bước khuếch đại là bắt buộc nếu sử dụng bộ điều hợp một phần. Khi sử dụng bộ điều hợp toàn phần, nếu DNA đầu vào <200 ng, khuyến nghị thực hiện khuếch đại; nếu không, không cần khuếch đại.
2. Số chu kỳ khuếch đại phải được kiểm soát chặt chẽ. Khuếch đại không đủ có thể dẫn đến năng suất thư viện thấp; Khuếch đại quá mức có thể dẫn đến tăng độ lệch, lỗi, đọc trùng lặp và sản phẩm ghép. Bảng 6 liệt kê các số chu kỳ được khuyến nghị hướng tới mục tiêu đạt được sản lượng thư viện là 1 μg.
Bàn 6 Số chu kỳ được khuyến nghị để tạo ra 1.000 ng sản lượng thư viện
| Đầu vào DNA | Số chu kỳ cần thiết để tạo ra 1 μg thư viện |
| 1000 ng | 2-4 |
| 500 ng | 2-4 |
| 250 ng | 4-6 |
| 100 ng | 5-7 |
| 50 ng | 7-9 |
| 10 ng | 9-11 |
| 5 ng | 10 - 12 |
| 1 ng | 12-15 |
| 100 trang | 16 - 18 |
Ghi chú：
1.Bàn 6 hiển thị số lượng tham số vòng lặp sử dụng các xét nghiệm DNA đầu vào chất lượng cao khoảng 200 bp. Chất lượng DNA FFPE thay đổi rất nhiều và khi chất lượng DNA kém hoặc độ dài thư viện dài, số chu kỳ cần phải được tăng lên phù hợp để có đủ thư viện.
2.TÔITrong quá trình xây dựng thư viện, cần lựa chọn kích thước f, khuyến nghị sử dụng số chu kỳ cao hơn cho Khuếch đại thư viện; nếu không, khuyến nghị sử dụng số chu kỳ thấp hơn.
3.TÔINếu sử dụng bộ điều hợp không đầy đủ, cần phải khuếch đại ít nhất 2 chu kỳ để tạo thành bộ điều hợp hoàn chỉnh.
6. Phân tích chất lượng thư viện
1. Chất lượng của các thư viện được xây dựng thường được phân tích bằng cách đo nồng độ và phân bố kích thước.
2. Thư viện'nồng độ có thể được đo bằng các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen hoặc qPCR.
3.KHÔNG khuyến khích sử dụng các phương pháp định lượng dựa trên độ hấp thụ như NanoDrop.
4. Nên sử dụng phương pháp qPCR để định lượng thư viện: các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen không thể phân biệt được các cấu trúc dsDNA không hoàn chỉnh (các đoạn chèn không có bộ chuyển đổi hoặc chỉ có một đầu được nối bằng bộ chuyển đổi) với các thư viện hoàn chỉnh. Phương pháp qPCR sẽ chỉ khuếch đại và đo các thư viện hoàn chỉnh với cả hai đầu được nối bằng bộ chuyển đổi (các thư viện có thể giải trình tự), do đó cung cấp phép đo chính xác hơn để tải.
5. Phân bố kích thước của thư viện có thể được phân tích bằng Agilent Bioanalyzer hoặc các thiết bị khác dựa trên nguyên tắc điện di mao quản hoặc vi lưu chất.
7. Vật liệu khác
1. Hạt từ tinh chế DNA: Hieff NGSTM Hạt lựa chọn DNA (
2. Bộ chuyển đổi: Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho Illumina:
3. Phân tích chất lượng thư viện: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip hoặc các sản phẩm tương đương khác; thuốc thử định lượng thư viện.
4. Các vật liệu khác: ethanol tuyệt đối, nước siêu tinh khiết vô trùng, đầu pipet lưu giữ thấp, ống PCR, giá đỡ từ tính, máy luân nhiệt, v.v.
Hướng dẫn
Bước 1. Kết thúc sửa chữa/dA-Taling
1. rã đông các thuốc thử được đề cập trong Bảng 7 . Đảo ngược để trộn đều các thuốc thử và cho vào đá để sử dụng sau.
2. Lắp ráp các thuốc thử theo Bảng 7 trên băng.
Bàn 7 Hệ thống phản ứng sửa chữa cuối cùng/ dA-Tailing
| Thành phần | Thể tích (μL) |
| DNA phân mảnh | x |
| Bộ đệm Endprep | 7 |
| Enzym Endprep | 3 |
| ĐD2Ồ | Lên đến 60 |
3. Trộn nhẹ bằng cách hút hoặc lắc, ly tâm trong thời gian ngắn để thu được dung dịch.
4. Đặt ống vào máy tuần hoàn nhiệt và cài đặt chương trình theo bảng 8.
Bàn 8 Sửa chữa cuối cùng/dA-Tailing chương trình phản ứng
| Nhiệt độ | Thời gian |
| Nắp đậy nóng 105 °C | TRÊN |
| 30 °C | 30 phút |
| 72 °C | 30 phút |
| 4 °C | Giữ |
Bước 2. Bộ chuyển đổi thắt chặt
1. Pha loãng bộ chuyển đổi đến nồng độ thích hợp theo Bảng 2-5.
2. rã đông các thuốc thử được đề cập trong Bảng 9 . Đảo ngược để trộn đều các thuốc thử và cho vào đá để sử dụng sau.
3. Lắp ráp các thuốc thử theo Bảng 9 trên băng.
Bàn 9 Bộ chuyển đổi thắt chặt nốt Rêhệ thống hành động
| Thành phần | Thể tích (μL) |
| DNA đuôi dA（Sản phẩm từ bước 1) | 60 |
| Tăng cường thắt chặt | 30* |
| Bộ chuyển đổi DNA | 5** |
| Nhanh T4 DNA Ligase | 10 |
| ddH2O | 5 |
| Tổng cộng | 110 |
Ghi chú: *Chất tăng cường thắt ống dẫn tinh có độ nhớt. Vui lòng trộn đều bằng cách đảo ngược hoặc nghiêng và ly tâm sơ qua trước khi sử dụng.
**Nồng độ ban đầu của Ánh sángTM bộ chuyển đổi của YEASE là 15 μM. Vui lòng pha loãng bộ chuyển đổi theo lượng đầu vào Và giữ thể tích của bộ chuyển đổi cố định ở mức 5 μL.
**Nồng độ ban đầu của MGITM bộ chuyển đổi của YEASE là 10 μM. Vui lòng pha loãng bộ chuyển đổi theo lượng đầu vào Và giữ thể tích của bộ chuyển đổi cố định ở mức 5 μL.
4. Trộn đều bằng cách nhẹ nhàng hút lên xuống và quay xuống một lúc để thu hết chất lỏng từ thành ống..
5. Ủ mẫu trong máy chu trình nhiệt được làm nóng trước như thể hiện trong Bảng. 10 và thực hiện phản ứng kết nối bộ điều hợp.
Bàn 10 Chương trình phản ứng gắn kết bộ chuyển đổi
| Nhiệt độ | Thời gian |
| Nắp đậy nóng 105°C | Tắt |
| 20°C | 15 phút |
| 4°C | Giữ |
Bước 3. Làm sạch hoặc lựa chọn kích thước sau khi nối bộ chuyển đổi
Bước này là để tinh chế hoặc chọn kích thước sản phẩm trong bước 2 bằng hạt từ tính. Quá trình thanh lọc có thể loại bỏ các bộ chuyển đổi cặn, bộ chuyển đổi dimer hoặc các sản phẩm không sử dụng được khác.
Sạch sẽN lên của DNA gắn kết bộ chuyển đổi
1. Chuẩn bị: thực hiện xét nghiệm Hieff NGSTM Lấy hạt DNA Selection ra khỏi tủ lạnh và để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút. Chuẩn bị ethanol 80% mới.
2. Trộn đều các hạt bằng cách đảo ngược hoặc đảo đỉnh.
3. Thêm vào 88 μL Hieff NGSTM Hạt chọn lọc DNA (0.8×, Hạt: DNA = 0.8:1) vào ống chứa sản phẩm đã gắn bộ chuyển đổi, đậy kín và trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4. Ly tâm trong thời gian ngắn để lấy dung dịch xuống, và đặt ống ly tâm lên giá từ. Sau khi các hạt từ được hấp thụ hoàn toàn (khoảng 5 phút), hãy cẩn thận loại bỏ chất lỏng.
5. Giữ ống trên giá đỡ từ tính, trực tiếp thêm 200 μL ethanol 80% mới pha vào ống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây và cẩn thận loại bỏ chất lỏng.
6. Lặp lại bước 5 một lần nữa.
7. Đặt ống trên giá từ, mở nắp và sấy khô các hạt cho đến khi các hạt nứt ra (không quá 5 phút).
8. Lấy ống ra khỏi giá đỡ từ tính để rửa giải và rửa giải DNA
1). Nếu sản phẩm không cần phải chọn kích thước, hãy thêm 21 μL ddH2O trực tiếp. Trộn đều bằng cách vortex hoặc hút lên xuống 10 lần. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Xoay ống trong thời gian ngắn và đặt lên giá từ. Khi dung dịch trong (khoảng 5 phút), chuyển 20 μL dịch trong sang ống PCR mới một cách cẩn thận mà không chạm vào các hạt từ.
2). Nếu sản phẩm cần được chọn kích thước, hãy thêm 102 μL ddH2O trực tiếp. Trộn đều bằng cách vortex hoặc hút lên xuống 10 lần. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Xoay ống trong thời gian ngắn và đặt lên giá từ. Khi dung dịch trong (khoảng 5 phút), chuyển 100 μL dịch trong sang ống PCR mới một cách cẩn thận mà không chạm vào các hạt từ.
Ghi chú:Nếu sản phẩm đã tinh khiết cần được lưu trữ, có thể rửa giải bằng đệm TE.
Lựa chọn kích thước của DNA gắn bộ chuyển đổi
1.Chuẩn bị: thực hiện xét nghiệm Hieff NGSTM Lấy hạt DNA Selection ra khỏi tủ lạnh và để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút. Chuẩn bị ethanol 80% mới.
2. Trộn đều các hạt bằng cách đảo ngược hoặc đảo đỉnh.
3. Dựa trên kích thước mục tiêu, thêm vòng hạt đầu tiên vào khuôn mẫu DNA tinh khiết 100 μL theo Bảng. 11. Trộn đều bằng cách lắc hoặc hút 10 lần.
Bàn 11 Tỷ lệ hạt:DNA được khuyến nghị để lựa chọn kích thước hạt dựa trên
| Kích thước thư viện DNA đã chèn | 150 - 250 điểm | 200-300 điểm chuẩn | 300-400 điểm chuẩn | 400-500 điểm chuẩn |
| Kích thước thư viện DNA cuối cùng | 250-350 điểm chuẩn | 350-450 điểm chuẩn | 450-550 điểm chuẩn | 550-650 điểm chuẩn |
| Tỷ lệ thể tích trong 1 thứ tròn (Hạt:DNA) | 0,80× | 0,70× | 0,60× | 0,55× |
| Tỷ lệ thể tích trong 2 và tròn (Hạt:DNA) | 0,20× | 0,20× | 0,20× | 0,15× |
Ghi chú: "×" trong bảng biểu thị thể tích mẫu DNA. Ví dụ, nếu chiều dài chèn của thư viện là 250 bp và thể tích DNA mẫu là 100 μL, thể tích hạt từ được sử dụng trong vòng phân loại đầu tiên là 0,7×100 μL=70 μL; thể tích hạt từ được sử dụng trong vòng phân loại thứ hai là 0,20×100 μL=20 μL. Thể tích hạt được khuyến nghị trong bảng dành cho DNA được gắn bộ chuyển đổi. Nếu quy trình lựa chọn kích thước được thực hiện trước khi gắn, vui lòng tham khảo các giao thức sản xuất của Hieff NGSTM Hạt chọn lọc DNA (Mã số: 12601).
4. TÔIủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
5. Xoay ống một lúc và đặt lên giá từ. Khi dung dịch trong (khoảng 5 phút), chuyển phần dịch nổi vào ống PCR mới.
6. Thêm vòng hạt chọn thứ hai vào mẫu từ bước 5 theo Bảng 11.Trộn đều bằng cách lắc hoặc hút lên xuống ít nhất 10 lần.
7. TÔIủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
8. Ly tâm trong thời gian ngắn để lấy dung dịch xuống, và đặt ống ly tâm lên giá từ. Sau khi các hạt từ được hấp thụ hoàn toàn (khoảng 5 phút), hãy cẩn thận loại bỏ chất lỏng.
9. Giữ ống trên giá đỡ từ tính, trực tiếp thêm 200 μL ethanol 80% mới pha vào ống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây và cẩn thận loại bỏ chất lỏng.
10. Lặp lại bước chân 9 lại.
11. Đặt ống trên giá từ, mở nắp và sấy khô các hạt cho đến khi các hạt nứt ra (không quá 5 phút).
12. Lấy ống ra khỏi giá đỡ từ tính để rửa giải, Và trực tiếp thêm 21 μL ddH2O. Trộn đều bằng cách vortex hoặc hút lên xuống và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. (Lưu ý: nếu cần bảo quản sản phẩm đã tinh khiết, vui lòng rửa giải trong đệm TE.) Quay nhanh ống và đặt lên giá đỡ từ tính cho đến khi chất lỏng trở nên trong suốt (khoảng 5 phút). Cẩn thận chuyển 20 μL dịch nổi sang ống PCR mới mà không chạm vào hạt.
Bước 4 khuếch đại thư viện
Bước này có thể làm giàu các sản phẩm đã được tinh chế hoặc chọn kích thước bằng cách khuếch đại PCR.
1. Rã đông danh sách thuốc thử trong bảng 12, đảo ngược và trộn đều, sau đó cho vào đá để sử dụng sau.
2. Lắp ráp phản ứng sau trong ống PCR đã được khử trùng.
Bàn 12 Phản ứng PCR DNA gắn kết bộ chuyển đổi hệ thống
| Thành phần | Thể tích (μL) |
| ADN gắn kết bộ chuyển đổi | 20 |
| CanaceTM Bản phối khuếch đại chuyên nghiệp | 25 |
| Hỗn hợp sơn lót* | 5 |
| Tổng cộng | 50 |
[Ghi chú]: * nếu sử dụng bộ chuyển đổi hoàn chỉnh, Hieff NGSTM Hỗn hợp mồi (
3. Trộn nhẹ bằng cách hút hoặc lắc, sau đó ly tâm trong thời gian ngắn để thu được dung dịch.
4. Đặt ống vào máy luân nhiệt và thiết lập chương trình theo bảng 13 để bắt đầu khuếch đại.
Bàn 13 Chương trình phản ứng khuếch đại PCR
| Nhiệt độ | Thời gian | Xe đạp |
| Nắp nóng để 105°C | TRÊN | - |
| 98°C | 45 giây | 1 |
| 98°C |
|
Tham khảo bảng 6 |
| 60°C | 30 giây | |
| 72°C | 30 giây | |
| 72°C | 1 phút | 1 |
| 4°C | Giữ | - |
Bước 5 Làm sạch sau khuếch đại/Lựa chọn kích thước
Sạch sẽ lên các bước tham khảo bước chân 3. Hieff NGSTM Hạt chọn DNA (0,9×, Hạt:DNA=0,9:1) được sử dụng để tinh chế sản phẩm PCR. Nếu cần chọn kích thước, vui lòng tham khảo bước chân 3.
Bước 6 Kiểm soát chất lượng của các thư viện cuối cùng
Chất lượng của thư viện được xây dựng thường được đánh giá bằng cách đo nồng độ và phân bố kích thước. Để biết chi tiết, vui lòng tham khảo Lưu ý 6.
Thanh toán & Bảo mật
Thông tin thanh toán của bạn được xử lý an toàn. Chúng tôi không lưu trữ chi tiết thẻ tín dụng cũng như không có quyền truy cập vào thông tin thẻ tín dụng của bạn.
Cuộc điều tra
Bạn cũng có thể thích
Câu hỏi thường gặp
Sản phẩm chỉ dành cho mục đích nghiên cứu và không dùng để điều trị hoặc chẩn đoán ở người hoặc động vật. Sản phẩm và nội dung được bảo vệ bởi các bằng sáng chế, nhãn hiệu và bản quyền thuộc sở hữu của
Một số ứng dụng có thể yêu cầu thêm quyền sở hữu trí tuệ của bên thứ ba.