Hieff NGS™ Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện DNA OnePot Pro V4 là bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện bằng enzym thế hệ tiếp theo được thiết kế để sử dụng với Illumina và nền tảng giải trình tự thông lượng cao MGI. So với các phương pháp chuẩn bị thư viện truyền thống, bộ dụng cụ này sử dụng các enzyme phân mảnh chất lượng cao, loại bỏ nhu cầu về các quy trình siêu âm cồng kềnh. Các mô-đun phân mảnh và sửa chữa đầu cuối được kết hợp thành một bước duy nhất, giúp giảm đáng kể cả thời gian và chi phí chuẩn bị thư viện. Bộ dụng cụ này phù hợp với nhiều loại mẫu, bao gồm bộ gen thực vật và động vật, bộ gen vi khuẩn, v.v., với phạm vi đầu vào mẫu từ 1 ng đến 1 μg. Phân mảnh bằng enzyme đảm bảo kích thước phân mảnh đồng đều giữa các loài khác nhau, với sự thay đổi tối thiểu giữa các loài. Ngoài ra, bộ dụng cụ này có thể được ghép nối với Illumina hoặc MGI bộ điều hợp và mồi để giải trình tự trên nền tảng thông lượng cao Illumina hoặc MGI.

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Kho

Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong 1 năm.

Ghi chú

1. Về hoạt động

1. Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần，vì sự an toàn của bạn.

2. Rã đông các thành phần ở nhiệt độ phòng. Sau khi rã đông, trộn đều bằng cách lắc, quay ống một lúc và đặt chúng vào đá để sử dụng sau.

3. Khi chuẩn bị dung dịch phản ứng của từng bước, nên sử dụng pipet để trộn đều hoặc lắc nhẹ. Lắc mạnh có thể làm giảm lượng thư viện đầu ra.

4. Rất khuyến khích sử dụng đầu pipet có lọc để tránh nhiễm chéo. Đảm bảo thay đổi đầu pipet khi xử lý các mẫu khác nhau.

5. Các thao tác không đúng cách rất có thể gây ra ô nhiễm khí dung, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Khuyến cáo nên cô lập vật lý bắt buộc các vùng trộn phản ứng PCR và các vùng xét nghiệm tinh chế sản phẩm PCR. Được trang bị các thiết bị như pipet chuyên dụng để xây dựng thư viện.Thực hiện vệ sinh thường xuyên cho từng khu vực bằng cách lau bề mặt bằng 0,5% natri hypoclorit hoặc 10% thuốc tẩy

6. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.

1. Bộ sản phẩm tương thích với 100 pg - 1000 ng DNA đầu vào. Rất khuyến khích sử dụng DNA đầu vào chất lượng cao với A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Các thí nghiệm sau đây có thể bị ảnh hưởng nếu nồng độ muối cao như tác nhân tạo phức kim loại được đưa vào DNA đầu vào. Chúng tôi khuyên bạn nên rửa mẫu DNA trong ĐD₂Ồ để phân mảnh.

3. Vui lòng tham khảo bảng 6 đối với thời gian phân mảnh của mẫu DNA chuẩn.Bộ dụng cụ này có độ phân mảnh thấp và cung cấp phạm vi GC đồng đều cho các mẫu DNA có nhiều thành phần GC khác nhau. Vui lòng điều chỉnh thời gian phân mảnh dựa trên yêu cầu thử nghiệm của bạn.

4. Để phân mảnh chính xác, vui lòng chuẩn bị phản ứng trên đá.

3. Thắt ống dẫn

1. Bộ chuyển đổi dài Illumina hoặc MGI (Bộ chuyển đổi mã vạch) và bộ chuyển đổi ngắn có sẵn để khách hàng lựa chọn theo yêu cầu thử nghiệm của mình.

2. Nên chọn bộ chuyển đổi thương mại chất lượng cao. Nếu chọn bộ chuyển đổi tự chế, vui lòng giao phó cho một công ty có kinh nghiệm trong tổng hợp mồi NGS và lưu ý nhu cầu kiểm soát ô nhiễm nghiêm ngặt. Ngoài ra, nên chuẩn bị dung dịch ủ DNA trong băng ghế sạch và chỉ vận hành một loại bộ chuyển đổi mỗi lần để tránh ô nhiễm chéo.

3. Vui lòng rã đông bộ chuyển đổi trên đá hoặc ở nhiệt độ 4°C; khi vận hành ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ phòng thí nghiệm không được vượt quá 25°C để tránh bộ chuyển đổi bị biến tính.

4. Chất lượng và nồng độ của bộ điều hợp sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả gắn kết và sản lượng thư viện. Nồng độ bộ điều hợp quá cao sẽ tạo điều kiện cho sự hình thành dimer bộ điều hợp trong khi quá ít bộ điều hợp sẽ làm giảm tốc độ gắn kết và sản lượng thư viện. Pha loãng tương ứng với đệm TE theo lượng DNA đầu vào khi sử dụng bộ điều hợp. Bảng 2 -3 liệt kê các phương pháp pha loãng Bộ chuyển đổi được khuyến nghị cho các lượng DNA đầu vào khác nhau khi sử dụng bộ dụng cụ này.

Bảng 1 Lượng bộ chuyển đổi Illumina được khuyến nghị cho các DNA đầu vào khác nhau

Bảng 2 Lượng bộ điều hợp MGI được khuyến nghị cho các DNA đầu vào khác nhau

4. Làm sạch DNA dựa trên hạt và lựa chọn kích thước

1. Bước lựa chọn kích thước đoạn DNA có thể được thực hiện sau khi gắn bộ điều hợp hoặc sau khi khuếch đại thư viện.

2. Nên thực hiện lựa chọn kích thước ngay sau khi thắt bộ chuyển đổi nếu lượng DNA đầu vào lớn hơn 50 ng; nếu không, vui lòng thực hiện chọn kích thước sau khi khuếch đại.

3. Chất tăng cường thắt có chứa nồng độ PEG cao, có thể gây ra tác động đáng kể đến việc lựa chọn kích thước chính xác. Do đó, nếu việc lựa chọn kích thước được thực hiện ngay sau khi thắt bộ chuyển đổi, chúng tôi khuyến nghị nên thêm bước làm sạch hạt trước khi lựa chọn kích thước. Bước lựa chọn kích thước có thể được thực hiện trực tiếp nếu được thực hiện trước khi sửa chữa cuối/dA-tailing hoặc sau sự khuếch đại của thư viện.

4. Các hạt từ tính phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng, nếu không năng suất sẽ giảm và hiệu quả lựa chọn kích thước sẽ bị ảnh hưởng.

5. Các hạt từ tính phải được trộn đều bằng cách dùng máy trộn xoáy hoặc hút bằng pipet trước khi sử dụng.

6. Không hút các hạt khi chuyển dịch chất lỏng nổi, ngay cả lượng nhỏ các hạt cũng có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sau.

7. Ethanol 80% phải được pha chế mới, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi.

8. Để lựa chọn kích thước chính xác, khuyến nghị bắt đầu với thể tích lớn hơn 100 μL. Nếu ít hơn, khuyến nghị tăng thể tích lên 100 μL bằng nước siêu tinh khiết.

9. Hạt từ tính nên được sấy khô ở nhiệt độ phòng trước khi rửa giải sản phẩm. Độ khô không đủ sẽ dễ khiến etanol còn lại ảnh hưởng đến các phản ứng tiếp theo; độ khô quá mức sẽ khiến hạt từ tính bị nứt và làm giảm hiệu suất tinh chế. Thông thường, sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút là đủ để hạt khô hoàn toàn.

10. Nếu cần, các mẫu DNA đã được tinh chế hoặc chọn kích thước sẽ được rửa giải trong 0,1× Đệm TE có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 tuần hoặc ở nhiệt độ -20°C trong một tháng.

5. Khuếch đại thư viện

1. Việc có thực hiện khuếch đại thư viện hay không phụ thuộc vào lượng DNA đầu vào, loại bộ điều hợp, ứng dụng dữ liệu giải trình tự, v.v. Bước khuếch đại là bắt buộc nếu sử dụng bộ điều hợp một phần. Khi sử dụng bộ điều hợp toàn phần, nếu DNA đầu vào <200 ng, khuyến nghị thực hiện khuếch đại; nếu không, không cần khuếch đại.

2. Số chu kỳ khuếch đại phải được kiểm soát chặt chẽ. Khuếch đại không đủ có thể dẫn đến năng suất thư viện thấp; Khuếch đại quá mức có thể dẫn đến tăng độ lệch, lỗi, đọc trùng lặp và sản phẩm ghép. Bảng 3 liệt kê các số chu kỳ được khuyến nghị hướng tới mục tiêu đạt được sản lượng thư viện là 1 μg.

Bảng 3 Số chu kỳ được khuyến nghị để tạo ra 1.000 ng sản lượng thư viện

Ghi chú：

1. Bảng 3 hiển thị số lượng tham số vòng lặp sử dụng các xét nghiệm DNA đầu vào chất lượng cao khoảng 200 bp. Chất lượng DNA FFPE thay đổi rất nhiều và khi chất lượng DNA kém hoặc độ dài thư viện dài, số chu kỳ cần phải được tăng lên phù hợp để có đủ thư viện.

2.TÔITrong quá trình xây dựng thư viện, cần lựa chọn kích thước f, khuyến nghị sử dụng số chu kỳ cao hơn cho Khuếch đại thư viện; nếu không, khuyến nghị sử dụng số chu kỳ thấp hơn.

3.TÔINếu sử dụng bộ điều hợp không đầy đủ, cần phải khuếch đại ít nhất 2 chu kỳ để tạo thành bộ điều hợp hoàn chỉnh.

6. Phân tích chất lượng thư viện

1. Chất lượng của các thư viện được xây dựng thường được phân tích bằng cách đo nồng độ và phân bố kích thước.

2. Nồng độ trong thư viện có thể được đo bằng các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen hoặc qPCR.

3. KHÔNG khuyến khích sử dụng các phương pháp định lượng dựa trên độ hấp thụ như NanoDrop.

4. Nên sử dụng phương pháp qPCR để định lượng thư viện: các phương pháp dựa trên huỳnh quang như Qubit và PicoGreen không thể phân biệt được các cấu trúc dsDNA không hoàn chỉnh (các đoạn chèn không có bộ chuyển đổi hoặc chỉ có một đầu được nối bằng bộ chuyển đổi) với các thư viện hoàn chỉnh. Phương pháp qPCR sẽ chỉ khuếch đại và đo các thư viện hoàn chỉnh với cả hai đầu được nối bằng bộ chuyển đổi (các thư viện có thể giải trình tự), do đó cung cấp phép đo chính xác hơn để tải.

5. Phân bố kích thước của thư viện có thể được phân tích bằng Agilent Bioanalyzer hoặc các thiết bị khác dựa trên nguyên tắc điện di mao quản hoặc vi lưu chất.

7. Các vật liệu khác

1. Hạt từ tinh chế DNA: Hieff NGS^TM Hạt lựa chọn DNA (Yeasen Cat#12601) hoặc AMPure^® Hạt XP (A63880) hoặc các sản phẩm tương đương khác.

2. Bộ chuyển đổi: Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho Illumina: Yeasen Mã số mèo #13519-13520; 384 Mồi CDI kép: Yeasen Mèo#12412~Mèo#12413; 384 mồi có chỉ số kép độc đáo (UDI): Yeasen Con mèo số 12327~Mèo số 13330; Bộ chuyển đổi UMI UDI: Yeasen Mèo#13370~Mèo#13371; Bộ chuyển đổi hoàn chỉnh cho MGI: Yeasen Cat#13360-13362. Hỗn hợp mồi DNA：Con mèo#12190 hoặc Con mèo#12191.

3. Phân tích chất lượng thư viện: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip hoặc các sản phẩm tương đương khác; thuốc thử định lượng thư viện.

4. Các vật liệu khác: ethanol tuyệt đối, nước siêu tinh khiết vô trùng, đầu pipet lưu giữ thấp, ống PCR, giá đỡ từ tính, máy luân nhiệt, v.v.

8. Quy trình làm việc

Hình 1.Quy trình làm việc của Một nồi Chuyên nghiệp ADN Bộ dụng cụ chuẩn bị cho thư viện