Sự khuếch đại không đặc hiệu của Taq DNA polymerase là một vấn đề phổ biến trong các thí nghiệm PCR, ảnh hưởng trực tiếp đến việc giải thích kết quả phát hiện và có thể dẫn đến giảm độ nhạy khuếch đại, thậm chí làm giảm sản lượng của đoạn mục tiêu. Sử dụng các chất điều chỉnh enzyme để niêm phong trung tâm hoạt động của Taq DNA polymerase ở nhiệt độ phòng, do đó ức chế hoạt động của DNA polymerase của enzyme Taq ở nhiệt độ phòng, hiện là phương pháp hiệu quả nhất để ngăn chặn sự khuếch đại không đặc hiệu. Các kháng thể niêm phong kép do Yisheng phát triển không chỉ niêm phong hoạt động của polymerase của Taq DNA polymerase mà còn đồng thời niêm phong hoạt động của exonuclease của Taq DNA polymerase. Phương pháp tiếp cận kép này ngăn ngừa hiệu quả sự khuếch đại không đặc hiệu do ghép đôi sai hoặc các dimer mồi và cũng ngăn ngừa sự tạo ra các tín hiệu không đặc hiệu do sự phân hủy vật liệu, do đó tăng gấp đôi tính đặc hiệu của thuốc thử. Điều này cho phép thuốc thử phát hiện đối phó với việc vận chuyển hoặc sử dụng ở nhiệt độ phòng một cách dễ dàng.

1.Độ đặc hiệu khuếch đại cực cao—Kháng thể được niêm phong kép có thể đồng thời niêm phong cả hoạt động của polymerase và exonuclease, giúp tránh khuếch đại không đặc hiệu và tăng cường độ đặc hiệu.

2.Độ nhạy phát hiện đặc biệt—Công thức khởi động nóng đảm bảo phát hiện hiệu quả các gen có hàm lượng thấp, mang lại độ nhạy cao hơn.

3.Độ ổn định sản phẩm vượt trội—Hiệu suất ổn định khi đặt ở nhiệt độ 37°C trong 5 ngày hoặc ở nhiệt độ 4°C trong 10 ngày.

4.Độ ổn định đường cơ sở và tính tuyến tính tốt—Giải quyết vấn đề trôi đường cơ sở, mang lại tính tuyến tính tuyệt vời.

5.Giải phóng hoạt động của enzyme nhanh chóng—Hơn 95% hoạt động của enzyme có thể được giải phóng bằng cách đun nóng ở 95°C trong 20 giây.

6.Khả năng ứng dụng rộng rãi của enzyme—Thích hợp cho cả enzyme Taq dạng hoang dã và đột biến, với mỗi mg kháng thể có khả năng khóa 4-10 KU enzyme Taq.

1 Chặn hoạt động của exonuclease DNA polymerase Taq

Các đầu dò mồi tổng hợp lần lượt được đưa vào hỗn hợp phản ứng của Taq DNA polymerase không được niêm phong hoặc được niêm phong bằng kháng thể đóng kép, và các phản ứng được tiến hành ở 40°C. Các tín hiệu huỳnh quang của cả hai đều được phát hiện và người ta thấy rằng các kháng thể đóng kép có thể niêm phong hiệu quả hoạt động exonuclease của Taq DNA polymerase.

Hình 2. Phát hiện hiệu quả bịt kín của hoạt động kháng thể-endonuclease bịt kín kép.

02 Xác minh độ nhạy phát hiện

Tương ứng sử dụng Yeasenkháng thể niêm phong kép của 's và kháng thể của Công ty T để niêm phong enzyme Taq, tiếp theo là phát hiện các mẫu dương tính thông qua công nghệ ARMS-PCR, người ta thấy rằng enzyme Taq được niêm phong bởi YeasenKháng thể niêm phong kép của 's có độ chính xác cao hơn trong khuếch đại ARMS-PCR.

Màu đỏ:Yeasen kháng thể+Taq; Màu xanh: nhà cung cấp kháng thể A+Taq.

Hình 3. Đường cong khuếch đại của ARMS-PCR.

03 Xác minh độ ổn định (4°C trong 10 ngày, 37°C trong 5 ngày).

Sử dụng kháng thể đóng truyền thống và kháng thể đóng kép để lần lượt chặn Taq DNA polymerase, sau đó polymerase được tạo thành dung dịch premix hoàn chỉnh chứa mồi và đầu dò. Dung dịch này được để ở 4°C trong 10 ngày hoặc ở 37°C trong 1, 3 và 5 ngày, sau đó được sử dụng để khuếch đại 10.000 bản sao của plasmid ASF. Người ta quan sát thấy không có thay đổi đáng kể nào trong các đường cong khuếch đại và giá trị Ct.

Hình 4. Đường cong khuếch đại của 10.000 bản sao plasmid ASF sau khi Taq polymerase bị chặn bằng kháng thể chặn truyền thống (A) và kháng thể chặn kép (B), khuếch đại bằng hệ thống qPCR.

04 Phát hiện đường cơ sở

Trong một số điều kiện nhất định khi sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu kết hợp với các đệm và dụng cụ cụ thể, hiện tượng được gọi là trôi đường cơ sở có thể xảy ra. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng thể đóng kép có thể giải quyết hiệu quả vấn đề trôi đường cơ sở, do đó tạo điều kiện cho đường cơ sở ổn định hơn.

Hình 5. Đường cong khuếch đại của gen SARS-CoV-2 N (A) và gen ACT (B) trong phân tích qPCR.

05 Kiểm tra tính tuyến tính

Hỗn hợp phản ứng được bịt kín bằng kháng thể đóng kép được sử dụng để khuếch đại 100.000, 10.000, 1.000 và 100 bản sao của plasmid kép ASFV/ACT để tạo ra đường cong chuẩn. Như có thể thấy từ Hình 7, cả hai đều thể hiện tính tuyến tính tốt.

Hình 6. Đồ thị đường cong chuẩn cho gen ASFV và gen ACT được tạo ra bằng cách sử dụng hỗn hợp phản ứng khối kép.

06 Thử nghiệm giải phóng hoạt động của Enzym

Sử dụng kháng thể đóng kép (Cat#31303) từ Yeasen để niêm phong enzyme Taq, và cho nó chịu sốc nhiệt ở 95°C trong 20 giây, hoạt động của enzyme đã được phát hiện. Có thể quan sát thấy rằng sau 20 giây sốc nhiệt ở 95°C, 31303 có thể giải phóng hơn 95% hoạt động của enzyme, tương đương với kháng thể từ Công ty T.

Bảng 1. Sốc nhiệt ở 95°C trong 20 giây của enzyme.

07 Phát hiện Multiplex Taq Polymerase

Yeasenkháng thể đóng kép (Cat#31303) được sử dụng để niêm phong ba loại polymerase Taq (kiểu hoang dã + hai loại đột biến), với tỷ lệ niêm phong là 1μg đến 5U, và các giá trị huỳnh quang và hiệu quả niêm phong đã được đo. Người ta thấy rằng đối với các loại polymerase Taq khác nhau, YeasenCác kháng thể đóng kép của '(Cat#31303) đã thể hiện hiệu quả bịt kín tốt.

Bảng 2. Hiệu quả bị chặn của các loại Taq polymerase khác nhau.