Sự miêu tả
Bộ đếm tế bào-8 (CCK-8) là bộ phát hiện nhanh và có độ nhạy cao dựa trên thuốc thử WST-8 (muối monosodium 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium). WST-8 là thuốc thử nâng cấp của MTT và có thể được khử thành formazan màu vàng cam hòa tan trong nước cao bởi các dehydrogenase trong ty thể. Lượng formazan được tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Giá trị OD của formazan ở 450nm được phát hiện bởi máy đọc vi mạch có thể gián tiếp chỉ ra số lượng tế bào sống. Bộ dụng cụ này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc thuốc, xét nghiệm tăng sinh tế bào và độc tính tế bào, xét nghiệm độ nhạy thuốc khối u và phát hiện hoạt động của các yếu tố sinh học.
Ưu điểm của phương pháp CCK-8
1. So sánh phương pháp CCK-8 với các phương pháp phát hiện độc tính/tăng sinh tế bào khác.
| Phương pháp phát hiện | Phương pháp MTT | Phương pháp XTT | WST - 1 phương pháp | Phương pháp CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Độ hòa tan trong nước của sản phẩm formazan | Thấp (cần thêm dung môi hữu cơ để hòa tan rồi mới thử) | Cao | Cao | Cao |
| Đặc điểm sản phẩm | Bột | 2 chai dung dịch | Giải pháp | 1 chai dung dịch |
| Phương pháp sử dụng | Trộn vào dung dịch và sử dụng | Dung dịch được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng. | Ra khỏi hộp | Ra khỏi hộp |
| Độ nhạy phát hiện | Cao | Rất cao | Rất cao | Cao |
| Phát hiện thời gian | Dài | Ngắn | Ngắn | Ngắn nhất |
| Bước sóng phát hiện | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
| độc tính tế bào | Độc tính cao, biến mất hoàn toàn hình thái tế bào | Độc tính thấp, hình thái tế bào không thay đổi | Thấp độc tính, hình thái tế bào không thay đổi | Độc tính thấp, hình thái tế bào không thay đổi |
| Độ ổn định của thuốc thử | Tổng quan | Thấp | Tổng quan | Cao |
| Kiểm tra mẫu số lượng lớn | Có thể thực hiện được | Phù hợp | Phù hợp | Phù hợp |
2. Đỏ phenol và huyết thanh không ảnh hưởng đến việc phát hiện CCK-8.
3. Vì độc tính của thuốc thử CCK-8 rất thấp nên thời gian đo tối ưu có thể được xác định bằng cách đọc nhiều lần bằng máy đọc vi mạch tại các thời điểm khác nhau sau khi thêm thuốc thử CCK-8.
Vận chuyển và lưu trữ
Sản phẩm có thể được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15ºC ở nơi khô ráo, tránh ánh sáng trong vòng hai năm.
Các biện pháp phòng ngừa
1. Trong thí nghiệm đầu tiên, nên xác định số lượng tế bào cấy tối ưu và thời gian ủ tối ưu của thuốc thử CCK-8.
2. Nếu có thể, hãy sử dụng pipet đa kênh để giảm sự thay đổi giữa các giếng sao chép. Tránh tạo bọt khí trong thí nghiệm vì bọt khí sẽ ảnh hưởng đến kết quả đọc OD. Khi thêm thuốc thử CCK-8, khuyến cáo nên thêm gần thành đĩa nuôi cấy thay vì đưa vào môi trường nuôi cấy.
3. Tế bào bạch cầu có thể cần thời gian ủ lâu hơn.
4. Khi sử dụng đĩa 96 giếng tiêu chuẩn, số lượng tế bào được cấy ít nhất là 1.000 tế bào/giếng (100 μL). Độ nhạy phát hiện đối với tế bào bạch cầu tương đối thấp, do đó, khuyến cáo nên cấy ít nhất 2.500 tế bào/giếng (100 μL). Nếu sử dụng đĩa 24 giếng hoặc 6 giếng, hãy tính số lượng tế bào tương ứng cho mỗi giếng và thêm thể tích thích hợp của thuốc thử CCK-8 (thể tích thuốc thử CCK-8 được thêm vào là 10% thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi giếng của đĩa).
5.Nếu không có bộ lọc 450 nm, có thể sử dụng bộ lọc có độ hấp thụ trong khoảng 430-490 nm, nhưng bộ lọc 450 nm có thể đạt được độ nhạy phát hiện cao nhất.
6. Đỏ phenol không ảnh hưởng đến phép đo vì độ hấp thụ của đỏ phenol trong môi trường có thể bị loại bỏ bằng cách trừ đi độ hấp thụ của nhóm mẫu trắng.
7. Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần khi tiến hành thí nghiệm.
Hướng dẫn
I. Tạo đường cong chuẩn
1. Chuẩn bị huyền phù tế bào, xác định mật độ tế bào, sau đó cấy tế bào vào đĩa.
2. Pha loãng tuần tự các tế bào với môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ nhất định (như tỷ lệ 1:2) để tạo thành một gradient nồng độ tế bào, thường là 3-5 gradient nồng độ tế bào, 3-6 giếng sao chép cho mỗi nồng độ.
3. Sau khi mạ, nuôi cấy tế bào trong 2-4 giờ để chúng bám dính. Sau đó, thêm thuốc thử CCK-8, ủ trong một khoảng thời gian nhất định và đo giá trị OD. Vẽ đường cong chuẩn với số lượng tế bào là trục X và giá trị OD là trục Y. Theo đường cong chuẩn này, số lượng tế bào trong một mẫu chưa biết có thể được xác định (Tiền đề của việc sử dụng đường cong chuẩn này là các điều kiện thực nghiệm phải nhất quán).
II. Xét nghiệm khả năng sống của tế bào
1. Đặt tế bào tấm (100 μL/giếng) vào tấm 96 giếng. Đặt tấm vào tủ ấm (37°C, 5% CO2) trong một khoảng thời gian để ủ trước.
2. Thêm 10 μL thuốc thử CCK-8 vào mỗi giếng (cẩn thận không để bọt khí lọt vào giếng vì chúng sẽ ảnh hưởng đến giá trị OD) và trộn nhẹ nhàng.
3. Đặt đĩa vào máy ấp và ủ trong 1-4 giờ.
4. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc vi mạch.
5. Nếu giá trị OD không được đo ngay lập tức, hãy thêm 10 μL dung dịch HCl 0,1 M hoặc dung dịch SDS 1% w/v vào mỗi giếng, đậy nắp đĩa và bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Giá trị hấp thụ sẽ không thay đổi trong vòng 24 giờ.
III. Thử nghiệm tăng sinh tế bào và độc tính tế bào
1. Đặt tế bào tấm (100 μL/giếng) vào tấm 96 giếng. Đặt tấm vào tủ ấm (37°C, 5% CO2) trong vòng 24 giờ để ủ trước.
2. Thêm 10 μL nồng độ khác nhau của chất cần thử nghiệm vào đĩa.
3. Đặt đĩa vào máy ấp và ủ trong một khoảng thời gian nhất định (chẳng hạn như 6, 12, 24 hoặc 48 giờ).
4. Thêm 10 μL thuốc thử CCK-8 vào mỗi giếng (cẩn thận không để bọt khí lọt vào giếng vì chúng sẽ ảnh hưởng đến giá trị OD) và trộn nhẹ nhàng.
5. Đặt đĩa vào máy ấp và ủ trong 1-4 giờ.
6. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc vi mạch.
7. Nếu giá trị OD không được đo ngay lập tức, hãy thêm 10 μL dung dịch HCl 0,1 M hoặc dung dịch SDS 1% w/v vào mỗi giếng, đậy nắp đĩa và bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Giá trị hấp thụ sẽ không thay đổi trong vòng 24 giờ.
Ghi chú: Nếu chất đó có tính oxy hóa hoặc khử, hãy thay môi trường nuôi cấy cũ bằng môi trường mới (loại bỏ môi trường cũ, rửa tế bào hai lần bằng môi trường mới, sau đó thêm môi trường mới) trước khi thêm thuốc thử CCK-8 để loại bỏ tác dụng của chất đó.Nếu bản thân chất đó chỉ có Một nhẹ ảnh hưởng đến giá trị hấp thụ, không cần thay thế môi trường nuôi cấy và có thể loại bỏ ảnh hưởng của chất này bằng cách trừ giá trị hấp thụ của nhóm trắng với chất này.
Công thức tính toán
Tỷ lệ sống sót của tế bào =[(AC) /(BC)] x100%
Tỷ lệ ức chế =[(BA) /(BC)] x100%
A: Độ hấp thụ của nhóm thực nghiệm (độ hấp thụ của môi trường nuôi cấy chứa tế bào, thuốc thử CCK-8 và chất cần thử nghiệm)
B: Độ hấp thụ của nhóm đối chứng (độ hấp thụ của môi trường nuôi cấy chứa tế bào, thuốc thử CCK-8)
C: Độ hấp thụ của nhóm trắng (độ hấp thụ của môi trường nuôi cấy có chứa thuốc thử CCK-8)
Trích dẫn
[1] Sun L, Li P, Ju X, và những người khác. TRONG đặc điểm cấu trúc vivo của bộ gen RNA SARS-CoV-2 xác định các protein vật chủ dễ bị tổn thương do thuốc tái sử dụng. Cell. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. Glutamylation TAB1 liên kết với GFAT1 duy trì hoạt hóa p38 MAPK và thúc đẩy sự sống còn của tế bào ung thư phổi trong điều kiện thiếu glucose. Cell Discov. 2022;8(1):77. Xuất bản ngày 9 tháng 8 năm 2022. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(IF:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, et al. Hình dung động lực học RNA trong tế bào sống với RNA huỳnh quang sáng và ổn định. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Sự không đồng nhất của ferroptosis trong ung thư vú ba âm tính cho thấy một chiến lược kết hợp liệu pháp miễn dịch sáng tạo [được xuất bản trực tuyến trước khi in, ngày 11 tháng 10 năm 2022]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX, et al. GM-CSF làm trung gian cho sự trốn tránh miễn dịch thông qua việc điều hòa tăng biểu hiện PD-L1 trong u lympho tế bào T/sát thủ tự nhiên ngoài hạch. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Xuất bản ngày 29 tháng 5 năm 2021. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(NẾU:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y, et al. Protein vỏ SARS-CoV-2 gây ra các tổn thương bệnh lý giống như hội chứng suy hô hấp cấp tính (ARDS) và tạo thành mục tiêu kháng vi-rút. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, et al. FBXO34 thúc đẩy hoạt hóa HIV-1 tiềm ẩn bằng cách điều chế sau phiên mã. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(NẾU:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X, và cộng sự.Cảm biến chromatin tế bào chất bằng cGAS kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong nhiễm trùng SARS-CoV-2. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Xuất bản ngày 3 tháng 11 năm 2021. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(NẾU:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, et al. Melatonin tăng cường khả năng miễn dịch chống khối u NK do tần số vô tuyến gây ra, gây ra quá trình lập trình lại quá trình chuyển hóa ung thư và ức chế sự phát triển của nhiều khối u phổi. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Xuất bản ngày 1 tháng 9 năm 2021. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(NẾU:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, et al. Các protein WWC làm trung gian cho hoạt hóa LATS1/2 bởi Hippo kinase và ngụ ý một chiến lược ức chế khối u. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, et al. Sự monomethyl hóa arginine bởi PRMT7 kiểm soát khả năng miễn dịch bẩm sinh do vi-rút trung gian bởi MAVS. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Các tác nhân quang động siêu phân tử để oxy hóa đồng thời NADH và tạo ra gốc siêu oxit. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Xuất bản ngày 19 tháng 10 năm 2022. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, et al. Thiết kế hợp lý của một chất đánh dấu tăng cường độ nhạy để phát hiện chất ức chế APC-Asef hiệu quả. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Xuất bản ngày 24 tháng 8 năm 2022. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, et al. Sự thoái hóa tuần tự do cocktail PROTAC tạm thời của AURKA làm mất tế bào gốc bệnh bạch cầu tủy cấp tính. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(NẾU:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, et al. Phân tích phiên mã đã tiết lộ hốc cộng sinh của giàn giáo 3D để đẩy nhanh quá trình chữa lành khuyết tật xương. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(NẾU:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, et al. Liệu pháp nanozyme phủ màng tế bào giống bạch cầu trung tính cho tổn thương não do thiếu máu cục bộ và phục hồi chức năng thần kinh dài hạn. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, et al. Các nanovehicles polyfluorocarbon cung cấp oxy cải thiện oxy hóa khối u và tăng cường khả năng miễn dịch chống khối u do quang động lực học. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, et al. Chống hình thành mạch kết hợp với ức chế con đường thiếu oxy tạo điều kiện cho liệu pháp quang động liều thấp do tia X gây ra [xuất bản trực tuyến trước khi in, ngày 25 tháng 6 năm 2021]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, et al. Hệ thống nano cung cấp oxy lấy cảm hứng từ vi nang làm tăng cường điều biến trung gian xạ trị của mô đệm khối u và khả năng miễn dịch chống khối u. Vật liệu sinh học. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(NẾU:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, et al. Tuyển dụng và trưởng thành tế bào dendritic phụ thuộc vào tế bào sát thủ tự nhiên được kích hoạt bằng nanogel phản ứng để nhắm mục tiêu vào liệu pháp miễn dịch ung thư tuyến tụy. Nhỏ. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(NẾU:15.153)
Thanh toán & Bảo mật
Thông tin thanh toán của bạn được xử lý an toàn. Chúng tôi không lưu trữ chi tiết thẻ tín dụng cũng như không có quyền truy cập vào thông tin thẻ tín dụng của bạn.
Cuộc điều tra
Bạn cũng có thể thích
Câu hỏi thường gặp
Sản phẩm chỉ dành cho mục đích nghiên cứu và không dùng để điều trị hoặc chẩn đoán ở người hoặc động vật. Sản phẩm và nội dung được bảo vệ bởi các bằng sáng chế, nhãn hiệu và bản quyền thuộc sở hữu của
Một số ứng dụng có thể yêu cầu thêm quyền sở hữu trí tuệ của bên thứ ba.