Bộ dụng cụ phát hiện apoptosis tế bào Annexin V-EGFP/PI sử dụng Annexin V gắn nhãn EGFP làm đầu dò để phát hiện sự xuất hiện apoptosis tế bào sớm.
Nguyên lý phát hiện như sau: trong các tế bào sống bình thường, phosphotidylserine (PS) nằm ở mặt trong của màng tế bào, nhưng trong các tế bào chết theo chương trình sớm, PS lật từ mặt trong của màng tế bào ra bề mặt màng tế bào và tiếp xúc với môi trường ngoại bào. Annexin-V là Ca²⁺ -protein liên kết phospholipid phụ thuộc có trọng lượng phân tử từ 35 đến 36 kDa liên kết với PS với ái lực cao. Phosphatidyl serine có thể liên kết với màng của các tế bào chết theo chương trình sớm thông qua phosphatidyl serine lộ ra ở bên ngoài tế bào.
Ngoài ra, Propidium Iodide (PI) được cung cấp để phân biệt các tế bào sống sót sớm với các tế bào hoại tử hoặc chết theo chương trình muộn. PI là thuốc nhuộm axit nucleic, không thể đi qua màng tế bào nguyên vẹn của các tế bào bình thường hoặc các tế bào chết theo chương trình sớm nhưng có thể đi qua màng tế bào của các tế bào chết theo chương trình muộn và tế bào hoại tử và làm cho nhân tế bào có màu đỏ. Do đó, khi Annexin V được kết hợp với PI, PI đã bị loại khỏi các tế bào sống (Annexin V^-/PI^-) và các tế bào chết theo chương trình sớm (Phụ lục V⁺/PI^-). Các tế bào chết theo chương trình và hoại tử muộn có kết quả dương tính kép với cả EGFP và PI (Phụ lục V⁺/PI⁺).
Bộ dụng cụ này phù hợp cho phép đo lưu lượng tế bào và kính hiển vi huỳnh quang.

Thành phần sản phẩm

Vận chuyển và lưu trữ

Các thành phần được vận chuyển cùng với một túi đá và có thể được bảo quản ở nhiệt độ -20°C, tránh ánh sáng và tránh đông lạnh rồi rã đông nhiều lần trong vòng 1 năm.
[Lưu ý]: Nếu cần sử dụng nhiều lần trong thời gian ngắn, có thể bảo quản ở nhiệt độ 4℃ và tránh ánh sáng trong nửa năm.

Thận trọng

1) Vì apoptosis là một quá trình diễn ra nhanh chóng nên khuyến cáo nên phân tích mẫu trong vòng 1 giờ sau khi nhuộm.
2) Đối với các tế bào bám dính, tiêu hóa là bước quan trọng. Không sử dụng EDTA trong dung dịch tiêu hóa vì EDTA có thể ảnh hưởng đến sự liên kết của Annexin V với PS.
3) Annexin V-FITC, nhưng không phải Annexin V-EGFP, nên được sử dụng để cố định tế bào, chẳng hạn như để phát hiện apoptosis và chu kỳ tế bào cùng một lúc, vì EGFP sẽ bị biến tính và mất khả năng kích thích huỳnh quang trong quá trình cố định. Các tế bào được ủ với Annexin V-FITC trước khi cố định và Annexin V-FITC không liên kết được rửa sạch bằng đệm liên kết.Bởi vì tính thấm tế bào tăng lên trong quá trình cố định tạo ra các mảnh vụn tế bào có thể liên kết với Annexin V và ảnh hưởng đến kết quả.
4) Nếu mẫu là máu, hãy đảm bảo loại bỏ tiểu cầu khỏi máu. Vì tiểu cầu có chứa PS, có thể liên kết với Annexin V, gây ảnh hưởng đến kết quả. Có thể rửa sạch tiểu cầu bằng cách sử dụng chất đệm có chứa EDTA và ly tâm ở tốc độ 200 g.
5) Vui lòng ly tâm thuốc thử một lúc trước khi mở nắp và đổ chất lỏng trên thành trong của nắp xuống đáy ống để tránh chất lỏng bắn ra ngoài khi mở nắp.
6) Annexin V-EGFP và PI là những chất nhạy sáng, vì vậy hãy tránh ánh sáng trong quá trình vận hành.
7) Chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu!

Hướng dẫn

Thiết kế thí nghiệm
Ống nghiệm trắng: Sử dụng tế bào đối chứng âm tính không có Annexin V-EGFP và dung dịch nhuộm PI để điều chỉnh điện áp.
Các ống nhuộm đơn: Các tế bào đối chứng dương tính, chỉ bổ sung Annexin V-EGFP, được sử dụng để điều chỉnh sự bù trừ.
Ống phát hiện: Các tế bào được xử lý bằng Annexin V-EGFP và dung dịch nhuộm PI. Dữ liệu thực nghiệm thu được bằng cách điều chỉnh các thông số của ống trắng và ống thuốc nhuộm đơn.
1.1 Nhuộm mẫu
1) Tế bào treo: Tế bào được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở nhiệt độ 4 ° C.
tế bào bám dính: Sau khi tiêu hóa bằng trypsin không có EDTA, tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở 4 ° C. Thời gian tiêu hóa trypsin không nên quá dài để tránh kết quả dương tính giả.
2) Các tế bào được rửa bằng PBS đã làm lạnh trước hai lần, mỗi lần ở mức 300 g và ly tâm ở 4℃ trong 5 phút.
3) Các tế bào được tái huyền phù với đệm liên kết 1× và nồng độ được điều chỉnh thành 1~5 ×106/mL.
4) Thêm 100 μL huyền phù tế bào vào ống nghiệm lưu lượng tế bào 5 mL, thêm 5 μl Annexin V-EGFP, trộn đều các tế bào và ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng dưới ánh sáng.
5) Thêm 10 μl dung dịch PI và 400 μl PBS, tiến hành nhuộm ngay lập tức.
[Ghi chú]: Khi sử dụng phương pháp đo lưu lượng tế bào để phát hiện apoptosis, PI bị ảnh hưởng rất nhiều bởi thời gian, thời gian quá dài sẽ dẫn đến tăng độ nhuộm PI, do đó, phương pháp đo lưu lượng tế bào nên được hoàn thành trong vòng 1 giờ.
1.2 Phân tích tế bào dòng chảy
Bước sóng kích thích cực đại của EGFP là 488 nm và bước sóng phát xạ cực đại là 507 nm; Bước sóng kích thích cực đại của phức hợp PI-DNA là 535 nm và bước sóng phát xạ cực đại là 615 nm. Phần mềm như CellQuest được sử dụng để phân tích và vẽ một biểu đồ chấm hai màu, EGFP là trục hoành và PI là trục tung. Thu thập 10.000 sự kiện trên mỗi mẫu. Trong một thí nghiệm điển hình, các tế bào có thể được chia thành ba nhóm phụ, các tế bào sống chỉ có huỳnh quang nền cường độ rất thấp, các tế bào chết theo chương trình sớm chỉ có huỳnh quang màu xanh lá cây mạnh và các tế bào chết theo chương trình muộn có nhuộm kép huỳnh quang màu xanh lá cây và đỏ.