Nguyên lý phát hiện của bộ phát hiện apoptosis Annexin V-Alexa Fluor488/PI như sau: trong các tế bào sống bình thường, phosphotidylserine (PS) nằm ở mặt trong của màng tế bào, nhưng trong các tế bào apoptosis sớm, PS lật từ mặt trong của màng tế bào ra bề mặt màng tế bào và tiếp xúc với môi trường ngoại bào. Annexin-V là Ca²⁺ -protein liên kết phospholipid phụ thuộc có trọng lượng phân tử từ 35 đến 36KD, liên kết với ái lực cao với PS và liên kết với màng tế bào của các tế bào chết theo chương trình sớm thông qua phosphatidylserine được phơi bày ở bên ngoài tế bào.
Ngoài ra, Propidium Iodide (PI) được cung cấp để phân biệt các tế bào sống sót sớm với các tế bào hoại tử hoặc chết theo chương trình muộn. PI là thuốc nhuộm axit nucleic, không thể đi qua màng tế bào nguyên vẹn của các tế bào bình thường hoặc các tế bào chết theo chương trình sớm nhưng có thể đi qua màng tế bào của các tế bào chết theo chương trình muộn và tế bào hoại tử và làm cho nhân tế bào có màu đỏ. Do đó, khi Annexin V được kết hợp với PI, PI đã bị loại khỏi các tế bào sống (Annexin V^-/PI^-) và các tế bào chết theo chương trình sớm (Phụ lục V⁺/PI^-). Ngược lại, các tế bào chết theo chương trình và hoại tử muộn có kết quả dương tính kép với Alexa Fluor488 và PI (Phụ lục V⁺/PI⁺).

Thành phần sản phẩm

Vận chuyển và lưu trữ

Các thành phần được vận chuyển cùng với một túi nước đá và có thể bảo quản ở nhiệt độ -20°C trong 1 năm.

Thận trọng

1) Vì apoptosis là một quá trình diễn ra nhanh chóng nên khuyến cáo nên phân tích mẫu trong vòng 1 giờ sau khi nhuộm.
2) Đối với các tế bào bám dính, tiêu hóa là bước quan trọng. Không sử dụng EDTA trong dung dịch tiêu hóa vì EDTA có thể ảnh hưởng đến sự liên kết của Annexin V với PS.
3) Nếu mẫu là máu, hãy đảm bảo loại bỏ tiểu cầu khỏi máu. Vì tiểu cầu chứa PS, có thể liên kết với Annexin V, gây ảnh hưởng đến kết quả. Có thể sử dụng chất đệm có chứa EDTA và rửa sạch tiểu cầu bằng cách ly tâm ở tốc độ 200 g.
4) Vui lòng ly tâm thuốc thử một lúc trước khi mở nắp và đổ chất lỏng trên thành trong của nắp xuống đáy ống để tránh chất lỏng bắn ra ngoài khi mở nắp.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 và PI là những chất nhạy sáng và phải tránh xa ánh sáng khi xử lý.
6) Chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu!

Hướng dẫn

1.1 Mẫu nhuộm
1.a) Bình treo: Tế bào được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở nhiệt độ 4°C.
b) tế bào bám dính: Sau khi tiêu hóa bằng trypsin không có EDTA, tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở 4 °C. Thời gian tiêu hóa trypsin không nên quá dài để tránh kết quả dương tính giả.
2. Các tế bào được rửa hai lần bằng PBS được làm lạnh trước ở 4 °C, mỗi lần sử dụng 300g và ly tâm ở 4 °C trong 5 phút.
3. Các tế bào được tái huyền phù bằng cách thêm 250 μL đệm liên kết 1× và nồng độ được điều chỉnh thành 1×106/mL.
4. Thêm 100 μL dung dịch huyền phù tế bào vào ống nghiệm lưu lượng tế bào 5mL, thêm 5μL Annexin V-Alexa Fluor 488 và 10 μL PI, sau đó trộn nhẹ.
5. Phản ứng được giữ tránh xa ánh sáng và ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
6. Thêm 400 μL dung dịch đệm liên kết 1×, trộn đều và các mẫu được phát hiện bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào trong vòng 1 giờ.
[Lưu ý]: Để tránh mất tế bào trong quá trình rửa tế bào, có thể sử dụng một đầu nhỏ để hút chất lỏng.
1.2 Phân tích tế bào dòng chảy
Alexa Fluor488 có bước sóng kích thích tối đa là 488 nm và bước sóng phát xạ tối đa là 519 nm; Bước sóng kích thích tối đa của phức hợp PI-DNA là 535 nm và bước sóng phát xạ tối đa là 615 nm. CellQuest và các phần mềm khác đã được sử dụng để phân tích và vẽ một biểu đồ chấm hai màu với Alexa Fluor488 là trục hoành và PI là trục tung. Thu thập 10.000 sự kiện trên mỗi mẫu.
1.3 Phân tích kính hiển vi huỳnh quang
1) Nhỏ một giọt dung dịch tế bào nhuộm kép bằng Annexin V-FITC/PI lên phiến kính và phủ tế bào bằng một tấm kính che.
2) Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với bộ lọc hai màu. Tín hiệu huỳnh quang Annexin V-FITC có màu xanh lá cây và tín hiệu huỳnh quang PI có màu đỏ.