Khi tế bào trải qua quá trình apoptosis, chúng kích hoạt các enzyme endonuclease cắt DNA bộ gen giữa các nucleosome. Thang DNA 180-200bp được phát hiện bằng điện di sau khi chiết xuất DNA trong quá trình apoptosis.
Bộ phát hiện apoptosis TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 488) có thể được sử dụng để phát hiện sự phân mảnh DNA nhân trong quá trình apoptosis muộn của tế bào mô. Nguyên tắc là dưới tác động của Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 488-12-DUTP được kết hợp vào Terminal 3´ -hydroxyl (3´-OH) bị lộ ra trong quá trình đứt DNA bộ gen. Do đó, nó có thể được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang hoặc phương pháp đo lưu lượng tế bào.
Thuốc nhuộm Alexa Fluor 488 ổn định hơn và có tín hiệu mạnh hơn, tạo ra các điểm đánh dấu sáng hơn và khả năng chống dập tắt tốt hơn.
Bộ dụng cụ này có nhiều ứng dụng và có thể được sử dụng để phát hiện apoptosis trong các lát cắt đông lạnh hoặc parafin, cũng như trong các tế bào bám dính hoặc treo trong nuôi cấy.

Thành phần sản phẩm

Vận chuyển và lưu trữ

Các thành phần được vận chuyển cùng với một túi đá và có thể được bảo quản ở nhiệt độ -20°C trong 1 năm.

Thận trọng

1. Cần phải tự chuẩn bị PBS để rửa tế bào, dung dịch dập tắt huỳnh quang để hàn viên nén và paraformaldehyd 4% để cố định.

2. Chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu!

Hướng dẫn

1. Chuẩn bị mẫu
1.1 Các phần mô nhúng parafin
1.1.1.Các phần mô parafin được ngâm trong xylen trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và lặp lại một lần nữa để loại bỏ hoàn toàn parafin.
1.1.2. Ngâm các phần trong etanol 100% trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và lặp lại một lần nữa.
1.1.3.Ở nhiệt độ phòng, các mẫu được ngâm trong etanol nồng độ gradien (90, 80, 70%) trong 3 phút mỗi lần.
1.1.4.Rửa nhẹ các phần bằng PBS và thấm cẩn thận phần chất lỏng dư thừa xung quanh mẫu trên các phiến kính bằng giấy lọc. Trong trường hợp này, có thể sử dụng bút parafin hoặc bút kỵ nước để vẽ đường viền phân phối mẫu xung quanh mẫu, thuận tiện cho quá trình xử lý độ thấm hạ lưu và hoạt động dán nhãn cân bằng. Không để mẫu khô trong quá trình thí nghiệm. Đặt mẫu đã xử lý vào hộp ướt để giữ cho mẫu ướt.
1.1.5.2 mg/mL dung dịch Proteinase K được pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:100 để đạt nồng độ cuối cùng là 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL dung dịch Proteinase K có nồng độ 20 μg/mL được thêm vào từng mẫu sao cho phủ kín hoàn toàn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
[Ghi chú]: Proteinase K giúp các mô và tế bào trở nên thấm thuốc nhuộm ở các bước tiếp theo. Thời gian ủ quá dài sẽ làm tăng nguy cơ các phần mô rơi ra khỏi tấm mang ở các bước rửa tiếp theo, trong khi thời gian ủ quá ngắn có thể gây ra tình trạng xử lý thấm không đủ và ảnh hưởng đến hiệu quả đánh dấu. Để có được kết quả tốt hơn, có thể cần phải tối ưu hóa thời gian ủ của Proteinase K.
1.1.7.Rửa mẫu 2-3 lần bằng dung dịch PBS, nhẹ nhàng loại bỏ chất lỏng dư thừa và thấm cẩn thận chất lỏng xung quanh mẫu trên phiến kính bằng giấy lọc. Mẫu đã xử lý được đặt trong hộp ướt để giữ cho mẫu ẩm.
1.2 Phần mô đông lạnh
1.2.1. Lấy các phần đông lạnh ra và đưa về nhiệt độ phòng. Các phiến kính được nhúng vào dung dịch paraformaldehyd 4% (hòa tan trong PBS) và cố định và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
1.2.2. Nhẹ nhàng loại bỏ phần chất lỏng dư thừa và sử dụng giấy lọc để thấm cẩn thận phần chất lỏng dư thừa xung quanh mẫu trên phiến kính.
1.2.3. Các phiến kính được nhúng vào dung dịch PBS, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút và rửa lại bằng PBS tổng cộng 2 lần.
1.2.4. Nhẹ nhàng loại bỏ chất lỏng dư thừa và cẩn thận thấm lam kính bằng giấy lọc để loại bỏ chất lỏng dư thừa xung quanh mẫu. Trong trường hợp này, có thể sử dụng bút parafin hoặc bút kỵ nước để vẽ đường viền phân phối mẫu xung quanh mẫu, thuận tiện cho quá trình xử lý độ thấm hạ lưu và hoạt động dán nhãn cân bằng. Trong quá trình thí nghiệm, không để mẫu khô và đặt mẫu đã xử lý vào hộp ướt để giữ mẫu ướt.
1.2.5. Dung dịch Proteinase K 2 mg/mL được pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:100 để đạt nồng độ cuối cùng là 20 μg/mL.
1.2.6. Thêm 100 μL dung dịch Proteinase K có nồng độ 20 μg/mL vào mỗi mẫu sao cho phủ kín hoàn toàn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
[Ghi chú]: Proteinase K giúp các mô và tế bào thấm thuốc nhuộm ở các bước tiếp theo. Thời gian ủ quá dài sẽ làm tăng nguy cơ các phần mô rơi ra khỏi tấm mang ở các bước rửa tiếp theo, trong khi thời gian ủ quá ngắn có thể gây ra tình trạng xử lý thấm không đủ và ảnh hưởng đến hiệu quả đánh dấu. Có thể cần phải tối ưu hóa thời gian ủ của Proteinase K nếu không thu được kết quả tốt hơn.
1.2.7. Rửa mẫu 2-3 lần trong cốc thủy tinh hở có chứa dung dịch PBS.
[Lưu ý]: Để tránh mất mẫu do bong tróc trong bước làm sạch, khuyến cáo không nên rửa bình mà nên ngâm phiến kính trong dung dịch PBS 2-3 lần để làm sạch.
1.2.8. Nhẹ nhàng loại bỏ phần chất lỏng dư thừa và sử dụng giấy lọc để thấm cẩn thận phần chất lỏng xung quanh mẫu trên phiến kính.Mẫu đã xử lý được đặt trong hộp ướt để giữ độ ẩm cho mẫu.
1.3 Chuẩn bị tờ giấy thu thập tế bào
Các tế bào bám dính được nuôi cấy trên Lab-Tek của các phiến kính buồng. Sau khi xử lý gây apoptosis, các phiến kính được rửa hai lần bằng PBS.
1.4 Chuẩn bị các vết tế bào (Lấy các phiến kính phủ poly-lysine làm ví dụ)
1.4.1. Các tế bào được tái huyền phù trong PBS ở nồng độ khoảng 2 × 107 tế bào/mL, 50-100 μL huyền phù tế bào được hút vào các phiến kính phủ poly-lysine và nhẹ nhàng trải huyền phù tế bào ra bằng một phiến kính sạch.
1.4.2. Các tế bào được cố định và các phiến kính được nhúng vào bể nhuộm chứa 4% paraformaldehyde mới chuẩn bị trong PBS và đặt ở 4 ° C trong 25 phút.
1.4.3. Các slide được rửa sạch, nhúng vào PBS và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Rửa lại bằng PBS.
1.4.4. Nhẹ nhàng loại bỏ chất lỏng dư thừa và cẩn thận thấm lam kính bằng giấy lọc để loại bỏ chất lỏng dư thừa xung quanh mẫu. Trong trường hợp này, có thể sử dụng bút parafin hoặc bút kỵ nước để phác thảo sự phân bố của mẫu xung quanh mẫu để tạo điều kiện cho quá trình xử lý độ thấm hạ lưu và cân bằng các hoạt động dán nhãn. Trong quá trình thí nghiệm, không để mẫu khô và đặt mẫu đã xử lý vào hộp ướt để giữ cho mẫu ướt.
1.4.5. Dung dịch Proteinase K 2 mg/mL được pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:100 để đạt nồng độ cuối cùng là 20 μg/mL.
1.4.6. Thêm 100 μL dung dịch Proteinase K có nồng độ 20 μg/mL vào mỗi mẫu sao cho ngập hoàn toàn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút (cũng có thể nhúng mẫu vào dung dịch Triton X-100 0,2% được pha trong PBS và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để xử lý tính thấm).
[Ghi chú]: Proteinase K giúp các mô và tế bào thấm thuốc nhuộm ở các bước tiếp theo. Thời gian ủ quá dài sẽ làm tăng nguy cơ các phần mô rơi ra khỏi tấm mang ở các bước rửa tiếp theo, trong khi thời gian ủ quá ngắn có thể gây ra tình trạng xử lý thấm không đủ và ảnh hưởng đến hiệu quả đánh dấu. Có thể cần phải tối ưu hóa thời gian ủ của Proteinase K nếu không thu được kết quả tốt hơn.
1.4.7. Rửa mẫu 2-3 lần bằng PBS, nhẹ nhàng loại bỏ chất lỏng dư thừa và thấm cẩn thận chất lỏng xung quanh mẫu trên phiến kính bằng giấy lọc. Các mẫu đã xử lý được đặt trong hộp ướt.
2. Các bước xử lý DNase đối với các đối chứng dương tính
Sau khi mẫu thấm, tế bào được xử lý bằng DNase I để chuẩn bị các phiến kiểm soát dương tính. Quá trình này thường gây ra hầu hết các tế bào được xử lý để hiển thị huỳnh quang màu xanh lá cây.
[Ghi chú]: Xử lý tế bào bất động bằng Dnase I làm đứt gãy DNA nhiễm sắc thể, tạo ra nhiều đầu 3' của DNA có thể được gắn nhãn.
2.1. Pha loãng đệm DNase I 10 × với nước khử ion theo tỷ lệ 1:10 (cần 200 µL đệm DNase I 1× cho mỗi mẫu, tức là cần 20 µL đệm DNase I 10 × và 180 µL nước khử ion để pha loãng). Nhỏ một giọt 100 µl vào mẫu thấm và ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 1 μL DNase I (1U/μL) vào 100 μL đệm DNase I 1× còn lại để đạt được nồng độ cuối cùng là 10 U/mL.
2.2. Nhẹ nhàng rút chất lỏng ra, sau đó thêm 100 μL dung dịch đệm chứa 10 U/mL DNase I và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
2.3. Gõ nhẹ vào phiến kính để loại bỏ phần chất lỏng thừa và rửa kỹ phiến kính 3-4 lần trong bể nhuộm bằng nước khử ion.
[Lưu ý]: Phải sử dụng một bể nhuộm riêng cho các tiêu bản đối chứng dương tính, nếu không, DNase I còn sót lại trên các tiêu bản đối chứng dương tính có thể tạo ra nền cao trên các tiêu bản thử nghiệm.
3. Ghi nhãn và phát hiện
3.1.Đệm cân bằng (Đệm cân bằng 5 ×) được pha loãng với nước khử ion theo tỷ lệ 1:5 (cần 100μL đệm cân bằng 1 × cho mỗi mẫu).
3.2. Đệm cân bằng (100μL đệm cân bằng 1×) được thêm vào mỗi mẫu để cân bằng hoàn toàn diện tích và ủ trong 10-30 phút ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra, trượt vào VAT với 1 x đệm cân bằng để đảm bảo các tiêu bản được cân bằng. Rã đông hỗn hợp đánh dấu Alexa Fluor 488-12-DUTP trên đá trong khi cân bằng tế bào và chuẩn bị đủ đệm ủ TdT cho tất cả các thí nghiệm và phản ứng đối chứng dương tính tùy chọn theo Bảng 1. Đối với phản ứng chuẩn có diện tích nhỏ hơn 5 cm2, thể tích là 50 μl và 50 μl được nhân với số phản ứng đối chứng dương tính và thực nghiệm để xác định tổng thể tích đệm ủ TdT cần thiết. Đối với các mẫu có diện tích bề mặt lớn hơn, thể tích thuốc thử có thể tăng theo tỷ lệ.

Bảng 1 Đệm ủ TdT được chuẩn bị cho các thí nghiệm và phản ứng kiểm soát dương tính tùy chọn

[Hệ thống kiểm soát âm tính]: Một đệm ủ kiểm soát không có enzyme TdT đã được chuẩn bị và enzyme TdT được thay thế bằng ddH2O.
3.3. Hầu hết 100 μl đệm cân bằng 1× được rửa sạch bằng giấy thấm xung quanh khu vực cân bằng và sau đó 50 μl đệm ủ TdT được thêm vào diện tích tế bào 5 cm2. Không để tế bào bị khô. Sau đó, phải che chắn slide khỏi ánh sáng.
3.4. Đặt một tấm phủ bằng nhựa lên các tế bào để đảm bảo phân phối đều thuốc thử và đặt một khăn giấy thấm nước ở đáy hộp ướt. Các phiến kính được đặt trong hộp ướt và ủ ở 37 ℃ trong 60 phút. Bọc hộp ướt bằng giấy bạc để tránh ánh sáng.
[Lưu ý]: Có thể cắt đôi lớp kính phủ nhựa trước khi sử dụng. Gấp mép kính phủ để dễ tháo lắp và thao tác.
3.5. Các tấm phủ bằng nhựa được gỡ bỏ và các phần được ủ trong dung dịch PBS ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó, các phần được rửa hai lần bằng PBS mới.
3.6. Nhẹ nhàng lau dung dịch PBS xung quanh và ở mặt sau của mẫu bằng giấy lọc.
[Ghi chú]: Để giảm nền, sau khi rửa tiêu bản bằng PBS một lần, có thể rửa tiêu bản bằng PBS có chứa 0,1% Triton X-100 và 5 mg/mL BSA 3 lần, mỗi lần 5 phút, để các chất đánh dấu tự do chưa phản ứng được trong và sạch.
3.7. Các mẫu được nhuộm trong bể nhuộm, và các phiến kính được nhúng vào bể nhuộm chứa dung dịch PI (1 μg/mL, mới chuẩn bị và pha loãng với PBS) trong bóng tối và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. (Tùy chọn): Các mẫu được nhuộm trong bể nhuộm, và các phiến kính được nhúng vào bể nhuộm chứa dung dịch DAPI (2 μg/mL, mới chuẩn bị và pha loãng với PBS) trong bóng tối và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
3.8.Rửa mẫu, nhúng phiến kính vào nước khử ion và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lặp lại hai lần để rửa tổng cộng ba lần.
3.9. Lau khô phần nước thừa trên phiến kính và thêm 100 μl PBS vào khu vực lấy mẫu để giữ cho mẫu ẩm.
3.10. Các mẫu được phân tích ngay lập tức dưới kính hiển vi huỳnh quang, và huỳnh quang màu xanh lá cây được quan sát thấy ở 520±20 nm bằng thiết bị lọc huỳnh quang tiêu chuẩn. Huỳnh quang màu đỏ của PI được quan sát thấy ở > 620 nm, hoặc DAPI màu xanh lam được quan sát thấy ở 460 nm. Nếu cần, các slide có thể được lưu trữ qua đêm ở 4 ° C trong bóng tối.
[Ghi chú]: PI/DAPI có thể nhuộm cả tế bào bị apoptosis và không bị apoptosis màu đỏ/xanh lam, và chỉ trong nhân tế bào bị apoptosis mới có Alexa Fluor 488-12-DUTP được tích hợp và phát huỳnh quang màu xanh lục tại chỗ.
4. Các tế bào treo được phát hiện bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào
4.1. 3~5 × 106 tế bào được rửa hai lần bằng PBS bằng cách ly tâm (300 × g) ở 4 ° C, ly tâm ở 300 g ở 4 ° C trong 10 phút, sau đó huyền phù lại trong 0,5 mL PBS.
4.2. Các tế bào được cố định và thêm 5 mL dung dịch paraformaldehyde 1% được pha trong PBS và đặt trong đá trong 20 phút.
4.3. Các tế bào được ly tâm ở 300 × g ở 4 ° C trong 10 phút, và phần dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù trong 5 mL PBS. Lặp lại quá trình rửa một lần và các tế bào được tái huyền phù với 0,5 mL PBS.
4.4. Các tế bào được thấm, và 5 mL ethanol 70% được làm lạnh trước bằng đá được thêm vào và ủ ở -20 ° C trong 4 giờ. Các tế bào có thể được lưu trữ trong ethanol 70% ở -20℃ trong một tuần, hoặc các tế bào có thể thấm với dung dịch Triton X-100 0,2% được chuẩn bị trong PBS và lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4.5. Các tế bào được ly tâm ở tốc độ 300 × g trong 10 phút và được huyền phù lại trong 5 mL PBS. Ly tâm được lặp lại và huyền phù lại trong 1 mL PBS.
4.6. Chuyển 2×106 tế bào vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml.
4.7. Quá trình cân bằng được ly tâm ở 300×g trong 10 phút, sau đó loại bỏ phần dịch nổi và huyền phù lại bằng 80 μL 1×Equilibration Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4.8. Trong khi cân bằng tế bào, hỗn hợp nhãn Alexa Fluor 488-12-DUTP được làm tan chảy trên đá và chuẩn bị đủ đệm ủ TdT cho tất cả các phản ứng theo Bảng 1. Đối với phản ứng tiêu chuẩn gồm 2×106 tế bào, thể tích là 50 μL và tổng thể tích đệm ủ TdT cần thiết là 50 μL nhân với số phản ứng.
4.9. Các tế bào được ly tâm ở tốc độ 300×g trong 10 phút, phần dịch nổi được loại bỏ và chất kết tủa được tái huyền phù trong 50μL đệm ủ TdT và ủ ở 37℃ trong 60 phút, tránh ánh sáng. Các tế bào được tái huyền phù nhẹ nhàng sau mỗi 15 phút bằng micropipette.
4.10. Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 1 mL EDTA 20 mM và trộn nhẹ bằng micropipet.
4.11. Sau khi ly tâm ở 300g trong 10 phút, loại bỏ phần chất lỏng nổi và huyền phù lại kết tủa trong 1 mL dung dịch Triton X-100 0,1% được pha chế trong PBS, chứa 5 mg/mL BSA. Lặp lại dung dịch một lần và rửa tổng cộng hai lần.
4.12. Phần dịch nổi được loại bỏ bằng cách ly tâm ở tốc độ 300 g trong 10 phút và các tế bào được huyền phù lại trong 0,5 mL dung dịch 5μg/mLPI mới được chuẩn bị bằng PBS, chứa 250 μg RNase A không có DNase.
4.13. Các tế bào được ủ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4.14. Các tế bào được phân tích bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào, và huỳnh quang màu xanh lá cây được quan sát thấy ở 520±20 nm. Huỳnh quang màu đỏ của PI được quan sát thấy ở > 620 nm. PI có thể nhuộm cả tế bào chết theo chương trình và không chết theo chương trình thành màu đỏ, và chỉ trong nhân tế bào chết theo chương trình mới có Alexa Fluor 488-12-DUTP kết hợp và huỳnh quang màu xanh lá cây cục bộ.