Hướng dẫn

1. Chuẩn bị trước khi thí nghiệm

1） Chuẩn bị các thuốc thử và vật liệu cần thiết sẽ được sử dụng trong thí nghiệm.

2）Xác nhận sự phù hợp của công cụ qPCR

Bộ dụng cụ này có thể sử dụng trên các loại thiết bị qPCR sau:

1. Bio-Rad: CFX96
2. Thermo Scientific: Hệ thống PCR thời gian thực 7500；QuantStudio™5；
3. Phương pháp thí nghiệm

1） Trích xuất DNA

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng ' Bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA dư từ tính (Mã số # 18461ES cho khai thác thủ công và Mã số #18462ES cho tự động trích xuất) cho Chiết xuất DNA, Bạn Có thể thăm nom ' http:/www.yeasenbiotech.com '  vì cái

thông tin chi tiết và việc mua hàng.

Bộ dụng cụ (Mã số # 40619ES) chứa một bộ kiểm soát nội bộ (IC). Nếu thêm IC vào mẫu trước khi chiết xuất DNA, nó có thể xác minh toàn bộ quy trình (bao gồm chiết xuất DNA và phản ứng qPCR). Nếu thêm IC vào hỗn hợp chính qPCR

trực tiếp, IC chỉ hoạt động như một đối chứng qPCR.

2）Chuẩn bị hỗn hợp qPCR

1. Theo số lượng mẫu bao gồm Kiểm soát dương tính (PCS), Kiểm soát không có mẫu (NTC), Kiểm soát âm tính  dung dịch kiểm soát (NCS) và mẫu thử (TS) để tính số phản ứng. Chuẩn bị 2 phản ứng song song cho

mỗi mẫu nói chung.

* PCS：Tích cực điều khiển giải pháp；NTC：Không bản mẫu kiểm soát；NCS：Âm tính điều khiển giải pháp；TS：Kiểm tra mẫu. Có là KHÔNG nhu cầu ĐẾN trình diễn

cái vật mẫu chiết xuất vì Máy tính cá nhân Và NTC, nhưng NCS Và TS là cần thiết.

Giếng phản ứng (M1) = (1×NCS + N×TS） ×2

Giếng phản ứng (M2) = (1×PCS + 1×NTC) ×2

Giếng phản ứng (M3) = (1×PCS + 1×NTC+ N×TS) ×2

1. Rã đông trước lượng thuốc thử cần thiết trên đá theo thiết kế thí nghiệm và Bảng dưới đây.
2. Tính toán lượng qPCR Mix theo Số phản ứng. Xin lưu ý, nếu bộ dụng cụ sẽ được sử dụng cho các hoạt động GMP như phát hành sản phẩm, chúng tôi khuyến nghị sử dụng Bảng 1 và 2 để chuẩn bị; Nếu bộ dụng cụ sẽ chỉ được sử dụng cho nghiên cứu và không cần thêm IC trước khi chiết xuất sau khi đánh giá, sau đó làm theo Bảng 3 để biết

sự chuẩn bị. Xin lưu ý rằng không phải tất cả M1, M2 và M3 là cần thiết để là chuẩn bị.

Bảng 1 Hệ thống hỗn hợp qPCR cho M1

*Các cấu hình hệ thống TRONG Bàn 1 là dựa trên TRÊN cái tiền đề cái đó vi-rút là đã thêm trước chiết xuất vì cả hai NCS Và TS, vậy thì Nó là không cần thiết

ĐẾN thêm vào vi-rút khi qPCR Trộn chuẩn bị. IC thêm vào phương pháp trước trích xuất: Đầu tiên, pha loãng vi-rút qua 20 lần với ADN chất pha loãng, và thêm vào 1μL

pha loãng vi-rút vào trong mỗi 100μL Bài kiểm tra vật mẫu vì cái hơn nữa khai thác.

**Cái này bộ dụng cụ làm không bao gồm ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm. Nếu như ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là cần thiết vì cái Thực tế Thời gian PCR bộ khuếch đại cái đó Bạn là Hiện nay sử dụng, 50×ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm (Mã số # 10200ES) là khuyến khích vì sử dụng. TRONG cái này trường hợp, các đã thêm âm lượng là 0,8μL, BẰNG đã hiển thị TRONG Bàn 1. Nếu như sử dụng khác

thương hiệu của ROX sản phẩm, xin vui lòng tham khảo ĐẾN của họ hướng dẫn vì ROX phép cộng.Nếu như KHÔNG ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là yêu cầu, đã thêm âm lượng là 0 μL.

Bảng 2 Hệ thống qPCR Mix cho M2

*Các cấu hình hệ thống TRONG Bàn 2 là dựa trên TRÊN cái tiền đề cái đó vi-rút là không đã thêm TRONG Máy tính cá nhân Và NTC trước chiết xuất, Vì thế vi-rút nhu cầu ĐẾN là đã thêm trong lúc qPCR Trộn chuẩn bị. IC thêm vào phương pháp sau đó trích xuất: Pha loãng vi-rút qua 100 lần với ADN chất pha loãng Và thêm vào 1μL pha loãng vi-rút vào trong

mỗi qPCR Trộn hệ thống.

**Cái này bộ dụng cụ làm không bao gồm ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm. Nếu như ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là cần thiết vì cái Thực tế Thời gian PCR bộ khuếch đại cái đó Bạn là Hiện nay sử dụng, 50×ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm (Mã số # 10200ES) là khuyến khích vì sử dụng. TRONG cái này trường hợp, các đã thêm âm lượng là 0,8μL, BẰNG đã hiển thị TRONG Bàn 1. Nếu như sử dụng khác

thương hiệu của ROX sản phẩm, xin vui lòng tham khảo ĐẾN của họ hướng dẫn vì ROX cộng thêm. Nếu KHÔNG ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là yêu cầu, đã thêm âm lượng là 0 μL.

Bảng 3 Hệ thống trộn qPCR cho M3

*Các cấu hình hệ thống TRONG Bàn 3 là dựa trên TRÊN cái tiền đề cái đó vi-rút là không đã thêm ĐẾN mẫu trước khai thác, vì vậy vi-rút nhu cầu ĐẾN là đã thêm    trong lúc qPCR Trộn chuẩn bị. IC thêm vào phương pháp sau đó trích xuất: Pha loãng vi-rút qua 100 lần với ADN chất pha loãng Và thêm vào 1μL vào trong mỗi qPCR Trộn

hệ thống.

**Cái này bộ dụng cụ làm không bao gồm ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm. Nếu như ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là cần thiết vì cái Thực tế Thời gian PCR bộ khuếch đại cái đó Bạn là Hiện nay sử dụng, 50×ROX Thẩm quyền giải quyết Thuốc nhuộm (Mã số # 10200ES) là khuyến khích vì sử dụng. TRONG cái này trường hợp, các đã thêm âm lượng là 0,8μL, BẰNG đã hiển thị TRONG Bàn 1. Nếu như sử dụng khác

thương hiệu của ROX sản phẩm, xin vui lòng tham khảo ĐẾN của họ hướng dẫn vì ROX cộng thêm. Nếu KHÔNG ROX thẩm quyền giải quyết thuốc nhuộm là yêu cầu, đã thêm âm lượng là 0 μL.

3）Thêm mẫu

1. Trộn qPCR Trộn với lắc đủ mạnh, ly tâm ở tốc độ thấp và thu thập chất lỏng còn lại từ nắp.

đến tận cùng của ống.

1. Thêm 20 μL qPCR Mix vào mỗi ống phản ứng/giếng. Xin lưu ý thêm qPCR Mix tương ứng vào mỗi

ống mẫu và tránh thêm lỗi.

1. Thêm mẫu vào ống/giếng chứa hỗn hợp qPCR. Xem Bảng 4 để biết thêm mẫu.

Bàn 4 Mẫu thêm vào

*Chúng tôi khuyến nghị sử dụng đệm pha loãng DNA (40619-E) làm khuôn mẫu của NCS để chiết xuất DNA.

**Các tổng cộng sự phản ứng lại âm lượng TRONG mỗi ống/giếng là 40 μL.

***Che phủ cái ống nắp đậy hoặc cái đĩa phim. Để tránh xa ảnh hưởng cái huỳnh quang tín hiệu đọc, làm ơn lấy chăm sóc không ĐẾN đánh dấu cái ống nắp đậy hoặc phim ảnh

hoặc thậm chí chà xát cái phim ảnh nhiều lần với Một dụng cụ cạo.

****Máy ly tâm cái sự phản ứng lại ống hoặc đĩa tóm lại Tại thấp tốc độ sau đó mẫu thêm vào. Sau đó hợp lý rung lắc Và trộn, lặp lại máy ly tâm

Tại thấp tốc độ ĐẾN sưu tầm cái chất lỏng từ cái nắp đậy hoặc tường ĐẾN cái đáy. Tránh bong bóng khi hoạt động. Các đường cơ sở sẽ là bị tác động nếu như cái trộn

là không hỗn hợp Vâng, vậy thì cái này bước chân là rất quan trọng ĐẾN Một Tốt cuộc thí nghiệm kết quả.

4）cài đặt chương trình qPCR

1. Cài đặt tập tin chương trình

Ví dụ (Thiết bị Hệ thống PCR thời gian thực 7500 và Phần mềm PCR thời gian thực v2.4):

Loại dụng cụ: 7500 (96 giếng)

Loại thí nghiệm: Định lượng-Đường cong chuẩn

Hóa học: Thuốc thử Taqman®

Tốc độ dốc: Tiêu chuẩn (~2 giờ để hoàn thành một lần chạy)

1. Cài đặt kênh mục tiêu

TRONG "Định nghĩa Mục tiêu Và Mẫu" của "Đĩa Cài đặt", tạo nên Một Mục tiêu 1 kênh (FAM), lựa chọn GIA ĐÌNH BẰNG cái báo cáo nhóm huỳnh quang và MGB hoặc không có như sự dập tắt huỳnh quang nhóm. Tạo nên Một Mục tiêu 2 kênh (VÙNG VIC), lựa chọn cái báo cáo huỳnh quang nhóm BẰNG VIC Và cái dập tắt huỳnh quang nhóm BẰNG không có. TRONG "Giao phó Mục tiêu Và Mẫu" của "Đĩa Cài đặt", nếu như KHÔNG thêm vào ROX thuốc nhuộm là đã thêm, chọn "không có"; Nếu một thêm vào ROX là đã thêm, chọn

ROX.

1. Cài đặt chương trình khuếch đại tiêu chuẩn

Bảng 5 Cài đặt chương trình khuếch đại chuẩn

1. Thiết lập đường cơ sở và ngưỡng:

Nguyên tắc của đường cơ sở điều chỉnh: sử dụng cái tự động đường cơ sở nói chung là. Nếu như nhu cầu ĐẾN điều chỉnh TRONG thủ công, chọn cái xe đạp trước khi tăng trưởng theo cấp số nhân thời kỳ như chu kỳ bắt đầu, và tránh vùng biến động của ban đầu huỳnh quang bộ sưu tập. Chọn chu kỳ cách Ct của mẫu khuếch đại hàm mũ sớm nhất 1-2 chu kỳ làm

điểm cuối.

Nguyên tắc của ngưỡng cửa điều chỉnh: sử dụng ngưỡng tự động nói chung. Nếu cần điều chỉnh thủ công, ngưỡng nên là bộ cao hơn hơn cái Tiêu cực vật mẫu hoặc cái đường cơ sở tiếng ồn, của nó nói chung là bộ ngưỡng cửa TRONG cái muộn

giai đoạn của cần có sự khuếch đại theo hàm mũ, ngưỡng tương đối độc lập và phù hợp cho mỗi đường hầm.

5） Kết quả Phân tích

1. Kết quả đánh giá cho PCS, NTC và NCS:

Nếu IC được thêm vào: thông số kỹ thuật của từng mẫu kiểm soát phải là thỏa mãn trong Bảng 6:

Bàn 6 Kết quả phán đoán của Máy tính, NTC Và NCS

Nếu không thêm IC: mỗi mẫu kiểm soát chất lượng phải đáp ứng thông số kỹ thuật của cột tín hiệu FAM trong Bảng 6 và không

cần phải phân tích Kênh VIC.

1. Kết quảphán quyết cho TS

Điều kiện tiên quyết: Nó là cần thiết để xác định xem Máy tính cá nhân, NTC và NCS đã vượt qua thông số kỹ thuật trong Bảng 6 trước TS phân tích kết quả. Nếu vượt qua thì có thể tiến hành đến bước tiếp theo. Nếu không đi qua, cái TS kết quả có thể không là đáng tin cậy, Và

lý do cần phải được điều tra.

Nếu IC được thêm vào: tìm kết quả tương ứng phán đoán theo thông tin kết quả của FAM và VIC trong Bảng 7:

Bàn 7: Kết quả phán đoán của TS (IC đã thêm)

*Nếu như ở đó là sự ức chế vì VIC tín hiệu,điều trị là cần thiết ĐẾN loại bỏ cái chất ức chế hoặc lặp lại cái Bài kiểm tra.

Nếu IC không được thêm vào: tìm kết quả tương ứng phán đoán theo thông tin kết quả của FAM trong Bảng 8 và không cần phải phân tích Tín hiệu VIC.

Bàn 8: Kết quả phán đoán của TS (IC không đã thêm)

Ghi chú

1. Vui lòng đọc kỹ hướng dẫn này trước khi sử dụng bộ dụng cụ này. Thí nghiệm phải được tiến hành theo cách chuẩn hóa, bao gồm xử lý mẫu, chuẩn bị hệ thống phản ứng và thêm mẫu.

2. Nếu có thể, hãy thực hiện các thao tác thêm mẫu và chuẩn bị thuốc thử trên đá.
3. Lắc đều và lắc đều từng loại thuốc thử trước khi sử dụng.

4. Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần，để sự an toàn của bạn.
5. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.