Polybrene (hexadimethrine bromide), còn được gọi là Polybrene, là một loại polymer cation thường được sử dụng trong các thí nghiệm chuyển gen DNA với các tế bào động vật có vú để tăng hiệu quả chuyển gen của liposome. Nó được sử dụng rộng rãi trong chuyển gen qua trung gian retrovirus và chuyển gen qua trung gian lentivirus. Cơ chế hoạt động có thể liên quan đến việc trung hòa axit sialic trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự hấp phụ bằng cách khắc phục lực đẩy tĩnh điện với các hạt virus. Polybrene cũng được công nhận là chất chống đông (chất đối kháng heparin) và thường được sử dụng trong sản xuất các tế bào hồng cầu kết tụ không đặc hiệu. Ngoài ra, trong giải trình tự protein, liều thấp Polybrene đã được chứng minh là cải thiện đáng kể sự phân hủy của các peptide trong phân tích giải trình tự tự động. Việc bổ sung Polybrene vào màng PVDF cũng có thể tăng cường ái lực của màng.

Đặc điểm kỹ thuật

Sản phẩm được cung cấp dưới dạng dung dịch, và bột được pha lại trong 0,9% NaCl để tạo thành dung dịch 10 mg/mL, sau đó được khử trùng bằng bộ lọc 0,22 μm. Thông thường, dung dịch được pha loãng theo tỷ lệ 1:1000-1:2000 để sử dụng, với tỷ lệ pha loãng cụ thể tùy thuộc vào loại tế bào, như đã nêu trong tài liệu liên quan.

Vận chuyển và lưu trữ

Khuyến cáo nên vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -20 ºC, thời hạn sử dụng là 2 năm. Nên chia nhỏ và bảo quản để tránh các chu kỳ đông lạnh-rã đông lặp lại.

Các biện pháp phòng ngừa:

1. Mặc trang phục phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn và sức khỏe.

2. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.

Các bước hoạt động

(để tham khảo, nồng độ cụ thể có thể thay đổi, hãy tham khảo tài liệu có liên quan):

Lưu ý: Polybrene có thể gây độc tính đáng kể đối với một số tế bào nhất định (như tế bào thần kinh biệt hóa cuối cùng, tế bào DC) và nên tiến hành thử nghiệm độc tính trước khi sử dụng lần đầu.

Thí nghiệm 1: Nhiễm trùng retrovirus

1. Chuẩn bị kho retrovirus tái tổ hợp: Nuôi cấy tế bào chứa một lớp tế bào đóng gói retrovirus chuyển gen đơn trong đĩa 100 mm với 5 mL môi trường nuôi cấy (5% huyết thanh). Sau 24 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy và lọc qua bộ lọc 0,45 μm.

2. Nuôi cấy tế bào để gây nhiễm trùng: Trong đĩa 100 mm, thêm 10 mL môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh có mật độ tế bào là 5x10⁵ mỗi món ăn.

3. Nhiễm virus: Sau 24 giờ nuôi cấy tế bào, loại bỏ toàn bộ môi trường nuôi cấy. Nhiễm tế bào bằng 2 ml dịch nuôi cấy virus có chứa Polybrene (nồng độ cuối cùng: 5-10 μg/mL) ở 37°C trong 3-6 giờ.

4. Thu thập các hạt virus: Thêm 8 mL môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh. Sau 2-3 ngày nuôi cấy, thu thập môi trường nuôi cấy để thu được các hạt virus.

Thí nghiệm 2: Chuyển gen

1. Nuôi cấy tế bào trong môi trường phát triển hoàn chỉnh với mật độ tế bào khoảng 50%.

2. Sau 18-24 giờ nuôi cấy tế bào, chuẩn bị hỗn hợp môi trường nuôi cấy DNA-Polybrene. Thêm môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (2 mL cho đĩa 60 mm, 3 mL cho đĩa 100 mm) và làm nóng trước ở 37°C. Trộn nhẹ 10 ng~10 µg plasmid. Thêm Polybrene đến nồng độ cuối cùng là 5-10 μg/mL. Trộn nhẹ nhàng. Mỗi thành phần phải được thêm vào theo thứ tự đã chỉ định.

3. Loại bỏ môi trường nuôi cấy và thêm dung dịch DNA-môi trường tăng trưởng-polybrene vào tế bào ở 37°C trong 6-20 giờ. Trộn nhẹ sau mỗi 1,5 giờ trong vòng 6 giờ đầu tiên nuôi cấy tế bào.

4. Loại bỏ môi trường nuôi cấy DNA-dung dịch Polybrene. Phủ tế bào bằng dung dịch sốc DMSO (15% DMSO trong 1× HBSS).Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy trong 10 giây mỗi lần thêm dung dịch để đảm bảo phân phối đều. Ủ tế bào ở 37°C trong 4 phút.

5. Loại bỏ ngay dung dịch sốc DMSO và rửa nhẹ tế bào hai lần bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh. Đối với đĩa 60 mm, rửa bằng 5 mL môi trường nuôi cấy mỗi lần và đối với đĩa 100 mm, rửa bằng 10 mL môi trường nuôi cấy mỗi lần.

6. Thêm môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh vào tế bào.

7. Biểu hiện protein: Sau 24-72 giờ nuôi cấy, thu thập tế bào để phân tích biểu hiện protein nếu cần.

Chọn lọc tế bào: Sau 24-72 giờ nuôi cấy, tùy thuộc vào tình trạng tế bào, chuyển sang môi trường chọn lọc mới và tiếp tục chọn lọc tế bào.