Vero Bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ được sử dụng để phân tích định lượng dư lượng DNA tế bào chủ Vero trong các mẫu trung gian, bán thành phẩm và thành phẩm của nhiều sản phẩm sinh học khác nhau.

Bộ dụng cụ này sử dụng đầu dò huỳnh quang Taqman và phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR), có giới hạn phát hiện tối thiểu mức fg và có thể phát hiện DNA tế bào Vero còn sót lại một cách cụ thể và nhanh chóng. Bộ dụng cụ cần được sử dụng cùng với Bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA còn sót lại (Mã số: 18461ES).

Sản phẩm Thành phần

^*IC：Kiểm soát nội bộ

Vận chuyển và lưu trữ

1. Vận chuyển bằng đá khô và được bảo quản ở nhiệt độ -20°C cho 2 năm

2. Sau khi nhận hàng, vui lòng kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ lưu trữ tương ứng ngay lập tức.

Thận trọng

1. Vui lòng đọc kỹ hướng dẫn này trước khi sử dụng thuốc thử này và thí nghiệm phải được chuẩn hóa, bao gồm cả việc xử lý mẫu, chuẩn bị hệ thống phản ứng và thêm mẫu.

2. Tốt nhất nên thực hiện việc thêm mẫu và chuẩn bị dung dịch trên đá.

3. Đảm bảo rằng mỗi thành phần được khuấy đều và ly tâm ở tốc độ thấp trước khi sử dụng.

4. Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần khi thực hiện thí nghiệm.

5. Sản phẩm này CHỈ dùng cho mục đích nghiên cứu!

Các mô hình dụng cụ áp dụng

Bao gồm nhưng không giới hạn ở:

Bio-Rad: Mô-đun quang CFX96.

Khoa học nhiệt: ABI 7500; Phần mềm ABI Quant Studio 5; Bước ABI OnePlus.

Sử dụng hướng dẫn

1. Vero Pha loãng chuẩn DNA và chuẩn bị đường cong chuẩn

Vero là gì? Kiểm soát DNA được pha loãng theo gradient bằng cách sử dụng đệm pha loãng DNA được cung cấp trong bộ dụng cụ, và nồng độ pha loãng là 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Xem hướng dẫn chi tiết bên dưới:

1.1 Rã đông Vero Đệm kiểm soát DNA và đệm pha loãng DNA trên đá. Sau khi rã đông hoàn toàn, lắc nhẹ để trộn đều và ly tâm ở tốc độ thấp trong 10 giây.

1.2 Lấy ra sáu ống nghiệm 1,5 mL sạch, đánh dấu 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Thêm 90 μL dung dịch pha loãng DNA và 10 μL Vero Kiểm soát DNA đến 1.Ống vi lọc 5 mL được dán nhãn 3 ng/μL và pha loãng thành 3 ng/μL. Trộn đều và sau đó ly tâm trong 10 giây. Đóng gói chuẩn DNA đã pha loãng và có thể bảo quản trong thời gian ngắn (không quá 3 tháng) ở nhiệt độ -80°C. Vui lòng tránh đông lạnh-rã đông nhiều lần.

1.4 Thêm 90 μL dung dịch pha loãng DNA vào các ống nghiệm, sau đó làm theo quy trình dưới đây để pha loãng theo thứ tự.

[Ghi chú]:

1. Cần có ba giếng sao chép cho mỗi nồng độ. Phạm vi phát hiện là 3 fg/μL-300pg/μL Và phạm vi này có thể được mở rộng nếu cần thiết.

2. Để giảm số lần đông lạnh-rã đông lặp lại và tránh nhiễm bẩn, nên lưu trữ kiểm soát DNA lần đầu tiên được chia thành từng phần ở nhiệt độ -80°C.

3. Sau khi rã đông, đệm pha loãng DNA có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C trong 7 ngày, nếu không sử dụng trong thời gian dài, vui lòng bảo quản ở nhiệt độ -20°C.

4. Đảm bảo mẫu được trộn đều hoàn toàn, lắc nhẹ hỗn hợp trong 15 giây đến 1 phút cho mỗi độ pha loãng gradient.

2. Chuẩn bị Kiểm soát thu hồi chiết xuất (ERC)

Đặt nồng độ của Vero DNA trong ERC khi cần thiết (mẫu ERC được chuẩn bị với 3 pg/μL DNA làm ví dụ), như sau:

2.1 Thêm 100 μL mẫu thử vào ống 1,5 mL sạch, sau đó thêm 10 μL 3pg/μL Vero Tiêu chuẩn DNA (③) và trộn đều, đánh dấu là ERC.

2.2 Thực hiện chiết xuất DNA của mẫu ERC cùng với các mẫu thử để chuẩn bị ERC tinh khiết vật mẫu.

3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát dương tính (PCS) (Tùy chọn)

Đặt nồng độ của Vero ADN trong PCS khi cần thiết (PCS được chuẩn bị với 3 pg/μL DNA làm ví dụ), như sau:

3.1 Thêm 100 μL 3 pg/μL Vero Tiêu chuẩn DNA (③) vào ống nghiệm 1,5 mL sạch, sau đó đánh dấu là PCS.

3.2 Thực hiện chiết xuất DNA của PCS cùng với các mẫu thử để chuẩn bị PCS tinh khiết.

4. Tiêu cực Chuẩn bị dung dịch kiểm soát (NCS)

Đặt đối chứng âm vào thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

4.1 Thêm 100 μL ma trận mẫu (hoặc đệm pha loãng DNA) vào ống 1,5 mL sạch, sau đó đánh dấu là NCS.

4.2 Thực hiện chiết xuất DNA từ mẫu NCS cùng với các mẫu thử nghiệm để chuẩn bị mẫu NCS tinh khiết.

5. Chuẩn bị Không Kiểm soát Mẫu (NTC)

Đặt không có mẫu kiểm soát trong thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

5.1 NTC không yêu cầu xử lý mẫu trước và có thể được cấu hình ở giai đoạn phát hiện hàm lượng DNA còn sót lại bằng qPCR.

5.2 Mẫu NTC trong mỗi ống hoặc giếng là 20 μL Trộn (tức là 16 μL Hỗn hợp Vero qPCR + 4 μL Vero Primer & hỗn hợp thăm dò) + 20 μL Đệm pha loãng DNA. Nên cấu hình ba giếng sao chép.

6. Hệ thống phản ứng PCR

[Ghi chú]:

1. Tính tổng thể tích phản ứng PCR theo số phản ứng: qPCR Mix =(số phản ứng+2) × (16+4) μL (bao gồm cả lượng mất đi của hai giếng phản ứng). Khuyến nghị nên thực hiện nhiều hơn ba lần lặp lại cho mỗi mẫu trong thí nghiệm.

2. Sau khi đậy nắp ống hoặc niêm phong tấm, ly tâm ống phản ứng hoặc tấm ở tốc độ thấp trong 10 giây. Sau khi lắc và trộn đủ trong 5 giây, ly tâm lại để thu thập chất lỏng từ nắp hoặc thành xuống đáy. Tránh tạo bọt khí trong quá trình vận hành.

Xem bảng bên dưới để biết cách thiết lập tấm được khuyến nghị:

Bố trí tấm bao gồm: 1 NTC (không bản mẫu kiểm soát), 1 NCS (kiểm soát tiêu cực giải pháp), 6 STD (đường cong chuẩn của 6 nồng độ chuẩn), 3 TS (mẫu thử nghiệm), 3 ERC (kiểm soát thu hồi chiết xuất), 1 PCS (mẫu kiểm soát dương tính).Ba giếng sao chép cho mỗi mẫu.

7. Hướng dẫn thiết lập cho thiết bị PCR (Phương pháp 2 bước)

Các hướng dẫn sau đây chỉ áp dụng cho thiết bị Thermo ABI 7500 qPCR (Phiên bản phần mềm 2.0). Nếu bạn sử dụng một thiết bị khác, hãy tham khảo hướng dẫn sử dụng thiết bị để biết hướng dẫn thiết lập.

7.1 Tạo một thí nghiệm mới, chọn mẫu định lượng tuyệt đối hoặc do người dùng xác định.

7.2 Trong giao diện 'Định nghĩa' và ngăn 'Mục tiêu', thêm một mục tiêu và đặt tên là FAM, chọn trình báo cáo là 'FAM' và trình dập tắt là 'không có'.

7.3 Trong ngăn 'Mẫu', lần lượt thêm tất cả thông tin mẫu. Sau đó chọn các giếng, chọn mục tiêu và các mẫu tương ứng. Đặt nhiệm vụ của Vero Tiêu chuẩn DNA là tiêu chuẩn và gán các giá trị 300000, 30000, 3000, 300, 300, 30, 3 (đơn vị nồng độ DNA trong mỗi giếng là fg/μL) trong cột Số lượng và đặt tên cho các giếng là STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, tương ứng. Đặt nhiệm vụ của NTC là NTC. Đặt NCS, TS, ERC và PCS là Không xác định và đặt tên cho chúng theo bố cục Mảng ở trên. Sau đó nhấp vào tiếp theo.

7.4 Thiết lập chương trình khuếch đại: thiết lập thể tích phản ứng là 40 μL.

8. Phân tích kết quả qPCR

8.1 Hệ thống sẽ tự động đưa ra Ngưỡng Trong bảng Biểu đồ khuếch đại của Phân tích. Ngưỡng do hệ thống đưa ra đôi khi quá gần với đường cơ sở, dẫn đến sự khác biệt lớn về Ct giữa các giếng sao chép. Bạn có thể điều chỉnh Ngưỡng theo cách thủ công đến vị trí thích hợp và nhấp vào Phân tích. Sau đó, bạn có thể kiểm tra ban đầu xem đường cong khuếch đại có bình thường trong Biểu đồ đa thành phần hay không.

8.2 Trong tab Phân tích kết quả, hãy xem lại biểu đồ Đường cong chuẩn. Xác minh các giá trị cho Độ dốc, Chặn Y, R2 và Hiệu quả. Đối với đường cong chuẩn chuẩn, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 Trong 'Xem bảng tốt' trong mục Phân tích, nồng độ của từng mẫu được hiển thị theo Số lượng, đơn vị là fg/μL, đơn vị có thể chuyển đổi sang pg/μL hoặc pg/mL trong báo cáo xét nghiệm.

Hướng dẫn sử dụng