Vi khuẩn E.coli Bộ dụng cụ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ được sử dụng để phân tích định lượng E.coli DNA của tế bào chủ còn sót lại trong các mẫu trung gian, bán thành phẩm và thành phẩm của nhiều sản phẩm sinh học khác nhau.

Bộ dụng cụ này sử dụng đầu dò huỳnh quang Taqman và phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR), có giới hạn phát hiện tối thiểu mức fg và có thể phát hiện nhanh chóng và cụ thể E. coli còn sót lại. DNA tế bào. Bộ dụng cụ này cần được sử dụng cùng với Bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA dư (Mã số: 18461ES).

Báo cáo xác thực

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Kho

Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ trong vòng 2 năm.

Cả 41308-A và 41308-B đều phải được bảo quản ở nơi tránh ánh sáng.

Các mô hình dụng cụ áp dụng

Bao gồm nhưng không giới hạn ở:

Bio-Rad: Mô-đun quang học CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Hướng dẫn

1. Vi khuẩn E. coli. Pha loãng chuẩn DNA và chuẩn bị đường cong chuẩn

Vi khuẩn E.coli Kiểm soát DNA được pha loãng theo gradient bằng cách sử dụng đệm pha loãng DNA được cung cấp trong bộ dụng cụ^*và sự pha loãng

nồng độ là 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL.

Xem hướng dẫn chi tiết bên dưới:

• Rã đông dung dịch đệm pha loãng DNA và kiểm soát coliDNA trên đá. Sau khi rã đông hoàn toàn, nhẹ nhàng lắc để trộn đều và ly tâm ở tốc độ thấp trong 10 giây.
• Lấy ra sáu ống nghiệm sạch 1,5 mL, được đánh dấu Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5.
• Thêm 90 μL đệm pha loãng DNA và 10 μL coliDNA Control vào ống nghiệm vi sinh 1,5 mL có nhãn Std0, cụ thể là pha loãng đến 3 ng/μL. Trộn đều và sau đó ly tâm trong 10 giây. Đóng gói nhỏ chuẩn DNA đã pha loãng và có thể bảo quản trong thời gian ngắn (không quá 3 tháng) ở -25~-15℃^**.Vui lòng tránh việc đông lạnh-tan băng nhiều lần.
• Thêm 90 μL dung dịch pha loãng DNA vào các ống khác^***, sau đó làm theo quy trình dưới đây để pha loãng theo chuỗi^****.

Bảng 1 Pha loãng gradient chuẩn

^*Cần có ba giếng sao chép cho mỗi nồng độ. Phạm vi phát hiện là 30 fg/μL~300pg/μL và phạm vi này có thể được mở rộng.

^**Để giảm số lần đông lạnh-rã đông lặp lại và tránh nhiễm bẩn, nên bảo quản mẫu đối chứng DNA theo từng phần ở nhiệt độ -25~-15℃ trong lần đầu tiên.

^***Sau khi rã đông, dung dịch pha loãng DNA có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C trong 7 ngày, nếu không sử dụng trong thời gian dài, vui lòng bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃.

^****Đảm bảo mẫu được trộn đều hoàn toàn, lắc nhẹ hỗn hợp trong 15 giây đến 1 phút cho mỗi lần pha loãng theo độ dốc.

2. Chuẩn bị Kiểm soát thu hồi chiết xuất (ERC)

Thiết lập nồng độ DNA E.coli trong ERC theo nhu cầu (mẫu ERC được chuẩn bị với 30 pg DNA E.coli làm ví dụ), như sau:

• Thêm 100 μL mẫu thử vào ống nghiệm 1,5 mL sạch, sau đó thêm 10 μL Chuẩn DNA E.coli 3pg/μL (Std3) và trộn đều, đánh dấu là ERC.
• Tiến hành chiết xuất DNA mẫu ERC cùng với các mẫu thử nghiệm để chuẩn bị mẫu ERC tinh khiết.

3. Chuẩn bị dung dịch đối chứng âm tính (NCS)

Đặt đối chứng âm vào thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

1) Thêm 100 μL mẫu nền (hoặc đệm pha loãng DNA) vào ống 1,5 mL sạch, sau đó đánh dấu là NCS.

2) Thực hiện chiết xuất DNA từ mẫu NCS cùng với các mẫu thử nghiệm để chuẩn bị mẫu NCS tinh khiết.

4. Chuẩn bị Không Kiểm soát Mẫu (NTC)

Thiết lập điều khiển không có mẫu trong thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

1) NTC không yêu cầu xử lý mẫu trước và có thể được cấu hình ở giai đoạn phát hiện DNA còn sót lại bằng qPCR.

2) Mẫu NTC trong mỗi ống hoặc giếng là 20 μL hỗn hợp (tức là 15 μL hỗn hợp E.coli qPCR + 5 μL hỗn hợp mồi và thăm dò E.coli) + 10 μL đệm pha loãng DNA. Nên cấu hình ba giếng sao chép.

5. Hệ thống phản ứng PCR

Bảng 2 Hệ thống phản ứng

^*Tính tổng thể tích phản ứng PCR theo số phản ứng: qPCR Mix =(số phản ứng+2) × (15+5) μL (bao gồm cả lượng mất đi của hai giếng phản ứng). Khuyến nghị nên thực hiện nhiều hơn ba lần lặp lại cho mỗi mẫu trong thí nghiệm.

^**Sau khi đậy nắp ống hoặc niêm phong tấm, ly tâm ống phản ứng hoặc tấm ở tốc độ thấp trong 10 giây. Sau khi lắc và trộn đủ trong 5 giây, ly tâm lại để thu thập chất lỏng từ nắp hoặc thành xuống đáy. Tránh tạo bọt khí trong quá trình vận hành.

Xem bảng bên dưới để biết cách thiết lập tấm được khuyến nghị:

Bảng 3 Máy tính trên bảng tham chiếu

Bố cục đĩa bao gồm: 5 Std (đường cong chuẩn của 5 nồng độ chuẩn), 1 NTC (không có mẫu đối chứng), 1 NCS (dung dịch đối chứng âm tính), 3 TS (mẫu thử nghiệm), 3 ERC (đối chứng thu hồi chiết xuất).Ba giếng sao chép cho mỗi mẫu.

6. Cài đặt hướng dẫn sử dụng dụng cụ PCR(phương pháp 2 bước) (ví dụ: thiết bị Thermo ABI 7500 qPCR, phần mềm Phiên bản 2.0)

Các hướng dẫn sau đây chỉ áp dụng cho thiết bị Thermo ABI 7500 qPCR (Phiên bản phần mềm 2.0). Nếu bạn sử dụng một thiết bị khác, hãy tham khảo hướng dẫn thiết bị áp dụng để biết hướng dẫn thiết lập.

1) Tạo một thử nghiệm mới, chọn mẫu định lượng tuyệt đối hoặc do người dùng xác định.

2) Tạo 1 đầu dò phát hiện, có tên là "E.coli-DNA", chọn chất huỳnh quang báo cáo là "FAM" và chất huỳnh quang dập tắt là "Không có". Huỳnh quang tham chiếu là "ROX" (huỳnh quang tham chiếu có thể dựa trên kiểu máy, v.v., hãy chọn xem bạn có cần thêm nó không).

3) Trong ngăn 'Mẫu', lần lượt thêm tất cả thông tin mẫu. Sau đó chọn các giếng, chọn mục tiêu và các mẫu tương ứng. Đặt nhiệm vụ của E.coli Chuẩn DNA làm chuẩn, và gán các giá trị 300000, 30000, 3000, 300, 30 (đơn vị nồng độ DNA trong mỗi giếng là fg/μL) vào cột Số lượng, và đặt tên cho các giếng là Std 1, Chuẩn 2, Chuẩn 3, Chuẩn 4, Chuẩn 5, tương ứng. Đặt nhiệm vụ của NTC là NTC. Đặt NCS, TS và ERC là Không xác định và đặt tên cho chúng theo bố cục Mảng ở trên. Sau đó nhấp vào tiếp theo.

4) Thiết lập chương trình khuếch đại: thiết lập thể tích phản ứng là 30 μL.

Bảng 4 Quy trình khuếch đại

7. Phân tích kết quả qPCR

1) Hệ thống sẽ tự động đưa ra Ngưỡng Trong bảng Biểu đồ khuếch đại của Phân tích. Ngưỡng do hệ thống đưa ra đôi khi quá gần với đường cơ sở, dẫn đến sự khác biệt lớn về Ct giữa các giếng sao chép. Bạn có thể điều chỉnh Ngưỡng theo cách thủ công đến vị trí thích hợp và nhấp vào Phân tích. Sau đó, ban đầu bạn có thể kiểm tra xem đường cong khuếch đại có bình thường trong Biểu đồ đa thành phần hay không.

2) Trong tab Phân tích kết quả, hãy xem lại biểu đồ Đường cong chuẩn. Xác minh các giá trị cho R², Hiệu quả, Độ dốc và Y-intercept. Đối với đường cong chuẩn chuẩn, R²>0,99, 90%<Eff%<110%, -3,6<Độ dốc<-3,1.

3) Trong ngăn 'Xem bảng giếng' trong mục Phân tích, nồng độ của từng mẫu được hiển thị theo Số lượng, đơn vị là fg/μL, đơn vị có thể được chuyển đổi trong báo cáo phân tích.

4) Các thiết lập tham số của kết quả phân tích cần phải dựa trên mô hình cụ thể và phiên bản phần mềm được sử dụng và thường có thể được thiết bị tự động diễn giải.

5) Tính toán tỷ lệ thu hồi đột biến dựa trên kết quả thử nghiệm của mẫu TS cần đo và tỷ lệ thu hồi đột biến ERC của mẫu, tỷ lệ thu hồi đột biến phải nằm trong khoảng 50%~150%.Công thức đo tỷ lệ thu hồi tăng đột biến: Thu hồi (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Thể tích rửa giải (μL) / Giá trị lý thuyết của lượng DNA bổ sung (ví dụ: pg) x 100%。

6) Giá trị Ct của NCS đối chứng âm tính phải lớn hơn giá trị trung bình của nồng độ Ct thấp nhất của chuẩn.

• Mẫu kiểm soát không có NTC phải là Không xác định hoặc giá trị Ct ≥3

Ghi chú

1. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn.

3. Vui lòng đọc kỹ hướng dẫn này trước khi sử dụng thuốc thử này và thí nghiệm phải được chuẩn hóa, bao gồm cả việc xử lý mẫu, chuẩn bị hệ thống phản ứng và thêm mẫu.

4. Đảm bảo rằng mỗi thành phần được khuấy đều và ly tâm ở tốc độ thấp trước khi sử dụng.

Thủ công