Bộ phát hiện Lentivirus có khả năng sao chép (RCL) được sử dụng để phát hiện định lượng các lentivirus đang nhân bản có thể xảy ra trong một nhiều loại sản phẩm tế bào liên quan đến lentivirus các vector tiềm ẩn nguy cơ.

Bộ dụng cụ này thiết kế các mồi đặc biệt cho Trình tự gen VSV-G của protein vỏ lentivirus. Và nó áp dụng taqman  đầu dò huỳnh quang và phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR), có giới hạn phát hiện ở mức 1 bản sao/μL và có thể phát hiện cụ thể và nhanh chóng nguy cơ lentivirus có khả năng sao chép. Bộ dụng cụ cần được sử dụng cùng với Bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA còn sót lại (Mã số: 18461ES).

Thành phần

* IC： Nội bộ điều khiển.

Kho

Sản phẩm này nên được bảo quản ở nhiệt độ -25~-15℃ cho 2 năm.

Cả 41311-A và 41311-B đều phải được bảo quản ở nơi tránh ánh sáng.

Áp dụng dụng cụ mô hình

Bao gồm nhưng không giới hạn ở: Bio-Rad: Mô-đun quang học CFX96; Thermo Scientific: ABI 7500; Phần mềm ABI Quant Studio 5; Bước ABI OnePlus.

Hướng dẫn

1. ADN của RCL Tiêu chuẩn pha loãng Và Tiêu chuẩn đường cong sự chuẩn bị

Kiểm soát DNA RCL được pha loãng theo gradient bằng cách sử dụng đệm pha loãng DNA có trong bộ dụng cụ* và sự pha loãng nồng độ là 5×10E7 bản sao/μL, 5×10E6 bản sao/μL, 5×10E5 bản sao/μL, 5×10E4 bản sao/μL, 5×10E3 bản sao/μL, 5×10E2 bản sao/μL, 5×10E1 bản sao/μL.

Xem hướng dẫn chi tiết bên dưới:

1) Rã đông dung dịch kiểm soát DNA RCL và dung dịch pha loãng DNA trên đá. Sau khi rã đông hoàn toàn, xoáy nhẹ nhàng để trộn và ly tâm ở tốc độ thấp trong 10 giây.

2) Lấy ra bảy ống nghiệm sạch 1,5 mL, được đánh dấu Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6.

3) Thêm 90 μL dung dịch đệm pha loãng DNA và 10 μL RCL DNA Control vào ống nghiệm 1,5 mL có nhãn Std0, cụ thể là   pha loãng đến 5×10E7 bản sao/μL. Trộn và sau đó ly tâm trong 10 giây. Đóng gói tiêu chuẩn DNA pha loãng và nó có thể được bảo quản trong thời gian ngắn (không quá 3 tháng) ở nhiệt độ -25~-15℃** .Vui lòng tránh việc đông lạnh-tan băng nhiều lần.

4) Thêm 90 μL dung dịch đệm pha loãng DNA vào các ống khác*** , sau đó làm theo quy trình dưới đây để các pha loãng nối tiếp**** .

Bảng 1 Pha loãng gradient chuẩn

*Ba sao chép giếng là yêu cầu vì mỗi sự tập trung. phát hiện phạm vi là 5×10E1 bản sao/μL~5×10E6 bản sao/μL Và cái này phạm vi Có thể là mở rộng nếu cần thiết.

** ĐẾN giảm bớt cái con số của lặp lại đông lạnh-tan băng Và tránh xa sự ô nhiễm, nó là khuyến khích ĐẾN cửa hàng cái ADN điều khiển TRONG phần trích dẫn Tại -25~-15℃ vì cái Đầu tiên thời gian.

*** Một lần rã đông, ADN pha loãng đệm có thể là được lưu trữ Tại 2-8°C vì 7 ngày, nếu không đã sử dụng vì Một dài thời gian, xin vui lòng cửa hàng Tại -25~-15℃ .

**** Làm Chắc chắn cái bản mẫu là hoàn toàn trộn, nhẹ nhàng lắc cái hỗn hợp vì 15 giây ĐẾN 1 phút vì mỗi độ dốc pha loãng.

2. Phục hồi trích xuất Điều khiển (ERC) sự chuẩn bị

Thiết lập nồng độ DNA RCL trong ERC theo nhu cầu (mẫu ERC được chuẩn bị với 5×10E4 sao chép DNA RCL như (ví dụ), như sau:

1) Thêm 100 μL mẫu thử vào ống 1,5 mL sạch, sau đó thêm 10 μL 5×10E3 bản sao/μL RCL DNA Chuẩn (Std4) và trộn đều, đánh dấu là ERC.

2) Tiến hành chiết xuất DNA mẫu ERC cùng với các mẫu thử nghiệm để chuẩn bị mẫu ERC tinh khiết.

3. Kiểm soát tiêu cực Giải pháp (NCS) sự chuẩn bị

Đặt đối chứng âm vào thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

1) Thêm 100 μL ma trận mẫu (hoặc đệm pha loãng DNA) vào ống 1,5 mL sạch, sau đó đánh dấu là NCS.

2) Thực hiện chiết xuất DNA của NCS mẫu cùng với các mẫu thử nghiệm để chuẩn bị NCS tinh khiết vật mẫu.

4. Không có mẫu Điều khiển (NTC) sự chuẩn bị

Thiết lập điều khiển không có mẫu trong thí nghiệm, các bước vận hành cụ thể như sau:

1) NTC không yêu cầu xử lý mẫu trước và có thể được cấu hình ở giai đoạn phát hiện qPCR của DNA còn sót lại nội dung.

2) Mẫu NTC trong mỗi ống hoặc giếng là 20 μL hỗn hợp (tức là 15 μL RCL qPCR hỗn hợp + 4 μL RCL Mồi & thăm dò Trộn + 1 μL IC) + 10 μL đệm pha loãng DNA. Nên cấu hình ba giếng sao chép.

5. PCR sự phản ứng lại hệ thống

Bảng 2 Hệ thống phản ứng

* Tính toán cái tổng cộng PCR sự phản ứng lại âm lượng qua cái con số của phản ứng: qPCR Trộn =(cái con số của phản ứng+2) × (15+4+1) μL (bao gồm cái tổn thất của hai giếng phản ứng). Khuyến nghị nên thực hiện nhiều hơn ba lần lặp lại cho mỗi mẫu trong thí nghiệm.

** Sau đó đóng nắp cái ống hoặc niêm phong cái tấm, máy ly tâm cái sự phản ứng lại ống hoặc đĩa Tại thấp tốc độ vì 10 giây sau hợp lý rung lắc Và trộn vì 5 giây, lặp lại máy ly tâm ĐẾN sưu tầm cái chất lỏng từ cái nắp đậy hoặc tường ĐẾN cái đáy. Tránh bong bóng trong lúc hoạt động.

Xem bảng bên dưới để biết cách thiết lập tấm được khuyến nghị:

Bảng 3 Máy tính đang bật thẩm quyền giải quyết Cái bảng

Bố cục của tấm bao gồm: 6 Std (đường cong chuẩn của 6 nồng độ chuẩn), 1 NTC (không có mẫu kiểm soát), 1 NCS (dung dịch kiểm soát âm tính), 3 TS (mẫu thử), 3 ERC (dung dịch kiểm soát thu hồi chiết xuất).Ba giếng sao chép cho mỗi mẫu.

6. Hướng dẫn thiết lập vì Một PCR Dụng cụ

Các hướng dẫn sau đây chỉ áp dụng cho Nhiệt độ Thiết bị ABI 7500 qPCR (Phần mềm phiên bản 2.0). Nếu bạn sử dụng một Đối với các nhạc cụ khác nhau, hãy tham khảo hướng dẫn sử dụng nhạc cụ để biết hướng dẫn thiết lập.

1) Tạo một thí nghiệm mới, chọn mẫu định lượng tuyệt đối hoặc do người dùng xác định.

2) Tạo 1 đầu dò phát hiện, có tên là "RCL-DNA", chọn chất huỳnh quang báo cáo là "FAM" và dập tắt chất huỳnh quang là "không có"; tạo thêm 1 đầu dò phát hiện, đặt tên là "IC" và chọn chất huỳnh quang báo cáo là "CY5" và dập tắt huỳnh quang là "không có". Huỳnh quang tham chiếu là ROX" (huỳnh quang tham chiếu có thể dựa trên mô hình nhạc cụ, v.v., chọn liệu bạn cần phải thêm nó).

3) Trong Bảng 'Mẫu', lần lượt thêm tất cả thông tin mẫu. Sau đó chọn giếng, chọn mục tiêu và các mẫu tương ứng. Đặt nhiệm vụ của tiêu chuẩn RCL DNA như tiêu chuẩn, và giao giá trị 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (đơn vị nồng độ DNA trong mỗi giếng là bản sao/μL) trong cột Số lượng và đặt tên  giếng Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, tương ứng. Đặt nhiệm vụ của NTC là NTC. Đặt NCS, TS và ERC là Không rõ, và đặt tên chúng theo cách bố trí mảng tương ứng ở trên. Sau đó nhấp vào tiếp theo.

4) Thiết lập chương trình khuếch đại: thiết lập thể tích phản ứng là 30 μL.

Bảng 4 Quy trình khuếch đại

7. Phân tích của qPCR kết quả

1) Hệ thống sẽ tự động đưa ra Ngưỡng Trong Bảng biểu đồ khuếch đại của Phân tích. Ngưỡng được đưa ra bởi hệ thống đôi khi quá gần với đường cơ sở, dẫn đến sự khác biệt lớn trong Ct giữa các giếng sao chép. Bạn có thể điều chỉnh thủ công Ngưỡng đến vị trí thích hợp và nhấp vào Phân tích. Sau đó, bạn có thể kiểm tra ban đầu đường cong khuếch đại có bình thường trong Biểu đồ đa thành phần không.

2) Trong kết quả Tab Phân tích, xem lại biểu đồ Đường cong chuẩn. Xác minh giá trị cho R2, Hiệu quả, Độ dốc và Giao điểm Y. Đối với đường cong chuẩn chuẩn, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Slope≤-3,1.

3) Trong 'Xem bảng tốt' trong Phân tích, nồng độ của từng mẫu được thể hiện ở Số lượng, đơn vị là bản sao/μL, đơn vị có thể được chuyển đổi trong báo cáo phân tích.

4) Các thiết lập tham số của phân tích kết quả cần phải dựa trên mô hình cụ thể và phần mềm phiên bản được sử dụng và thường có thể được công cụ tự động diễn giải.

5) Tính toán tỷ lệ phục hồi đột biến dựa trên kết quả thử nghiệm của mẫu TS được đo và mẫu đột biến phục hồi ERC, tỷ lệ phục hồi của gai là cần thiết nằm trong khoảng 50%~150%. Công thức đo tỷ lệ thu hồi tăng đột biến:

Phục hồi (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Thể tích rửa giải (μL) / Lý thuyết giá trị của lượng bổ sung DNA (ví dụ: bản sao) x100%。

6) CT giá trị của NCS kiểm soát tiêu cực phải lớn hơn giá trị trung bình của nồng độ Ct thấp nhất của cái tiêu chuẩn.

7) Mẫu điều khiển miễn phí NTC nên là Không xác định hoặc Ct giá trị ≥38.

Ghi chú

1. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.
2. Vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn.

3. Vui lòng đọc kỹ hướng dẫn này trước khi sử dụng thuốc thử này và thí nghiệm phải được chuẩn hóa, bao gồm xử lý mẫu, chuẩn bị hệ thống phản ứng và mẫu bổ sung.

4. Đảm bảo rằng mỗi thành phần được khuấy đều và ly tâm ở tốc độ thấp trước khi sử dụng.

Thủ công