Bộ xét nghiệm loài oxy phản ứng sử dụng thuốc thử thấm tế bào 2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) để đánh giá định lượng các loài oxy phản ứng trong các mẫu tế bào sống. DCFDA không huỳnh quang ưa béo dễ dàng đi qua màng tế bào thông qua quá trình khuếch tán thụ động sau đó là quá trình deacetyl hóa. Sản phẩm deacyl hóa là 2′,7′-dichlorofluorescein (DCHF) nhạy cảm với chất oxy hóa. DCHF sau đó bị oxy hóa bởi ROS để tạo thành DCF. DCF có độ huỳnh quang cao và được phát hiện bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang hoặc đo lưu lượng tế bào với sự kích thích/phát xạ ở 480 nm/525 nm. Rosup, một hỗn hợp hợp chất, là chất gây cảm ứng ROS và có thể được sử dụng làm đối chứng dương tính.

Thành phần sản phẩm

Vận chuyển và lưu trữ

Bộ sản phẩm này được vận chuyển kèm theo túi đá. Bảo quản ở nhiệt độ -20°C không có ánh sáng trong 1 năm. Tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần.

Phương pháp áp dụng

1. Chuẩn bị thuốc thử
Dung dịch DCFH-DA: Ly tâm nhanh ở tốc độ thấp trước khi mở. Chuẩn bị dung dịch DCFH-DA đang hoạt động bằng cách pha loãng 10 mM DCFH-DA trong môi trường không có huyết thanh để tạo ra nồng độ cuối cùng là 10 μM.
[Lưu ý]: DCFH-DA cũng có thể được pha loãng trong môi trường không có phenol đỏ. Sử dụng dung dịch DCFH-DA mới pha, không khuyến khích lưu trữ DCFH-DA pha loãng trong thời gian dài. Nồng độ chính xác của DCFH-DA cần thiết sẽ phụ thuộc vào dòng tế bào đang sử dụng nhưng phạm vi bắt đầu chung sẽ là 10-50 μM. Đối với một số tế bào nhất định, nếu huỳnh quang của đối chứng âm tính (không có đầu dò DCFH-DA) rất mạnh, hãy pha loãng DCFH-DA thành 2-5 μM và rút ngắn thời gian ủ một cách thích hợp.
Dung dịch Rosup: Chuẩn bị dung dịch làm việc Rosup 100 µM bằng cách pha loãng dung dịch gốc Rosup 100 mM trong môi trường không có huyết thanh. Nhìn chung, ủ với Rosup ở 37 ℃ trong 30 phút-4 giờ trong bóng tối có thể làm tăng đáng kể ROS.
[Lưu ý]: Thời gian ủ của Rosup sẽ phụ thuộc vào độ nhạy của dòng tế bào. Ví dụ, 30 phút đối với Hela và 1,5 giờ đối với MRC5. Nếu không thấy ROS tăng trong vòng 30 phút, thời gian cảm ứng hoặc nồng độ có thể được tăng lên một cách thích hợp. Nếu ROS tăng quá nhanh, thời gian cảm ứng hoặc nồng độ có thể được giảm xuống một cách thích hợp.
Thuốc: Chuẩn bị thuốc quan tâm trong môi trường hoàn chỉnh với 10% FBS hoặc dung dịch thích hợp khác đến nồng độ mong muốn.
2. Giao thức được khuyến nghị cho tế bào bám dính
a) Chuẩn bị tế bào: Nuôi cấy tế bào bám dính trong môi trường nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn một ngày trước khi tiến hành thí nghiệm để tỷ lệ hợp lưu tế bào đạt 70% tại thời điểm tiến hành thí nghiệm.
b) Cảm ứng thuốc: Loại bỏ môi trường. Phủ từng giếng bằng thuốc pha loãng không có huyết thanh đã chuẩn bị trước và ủ trong thời gian mong muốn ở 37°C trong bóng tối.
c) (Tùy chọn) Kiểm soát dương tính: Phủ dung dịch Rosup đã chuẩn bị trước lên giếng kiểm soát dương tính và ủ trong thời gian mong muốn ở 37°C trong bóng tối.
[Lưu ý]: Đối với các tế bào có thời gian kích thích ngắn (thường trong vòng 2 giờ), đầu dò cũng có thể được nạp trước, sau đó thêm Rosup hoặc thuốc quan tâm.
d) Nạp đầu dò ROS: Loại bỏ toàn bộ môi trường và rửa tế bào bằng môi trường không có huyết thanh 1-2 lần. Phủ từng giếng bằng dung dịch DCFH-DA đã chuẩn bị trước đó. Ủ ở 37℃ trong bóng tối trong 30 phút.
e) Loại bỏ môi trường và rửa tế bào 1-2 lần bằng môi trường không có huyết thanh để loại bỏ DCFH-DA tự do.
3. Giao thức được khuyến nghị cho tế bào treo
a) Chuẩn bị tế bào: Nuôi tế bào huyền phù lên khoảng 1,5 × 105 tế bào trên mỗi giếng vào ngày thí nghiệm.
b) Cảm ứng thuốc: Thu thập tế bào trong ống hình nón bằng cách ly tâm và tái huyền phù chúng trong một lượng thích hợp thuốc pha loãng không có huyết thanh đã chuẩn bị trước đó và ủ trong thời gian mong muốn ở 37°C trong bóng tối.
c) (Tùy chọn) Kiểm soát dương tính: Tái huyền phù các tế bào kiểm soát dương tính với dung dịch Rosup đã chuẩn bị trước đó và ủ trong thời gian mong muốn ở 37°C trong bóng tối.
d) Nạp mẫu dò ROS: Thu thập trong một ống mới và rửa tế bào bằng cách ly tâm hai lần trong PBS. Tái huyền phù các tế bào bằng dung dịch DCFH-DA đã chuẩn bị trước đó với mật độ tế bào là 1×106-2×107/mL. Sau đó ủ ở 37℃ trong 30 phút trong bóng tối. Đảo ngược ống sau mỗi 3-5 phút để đảm bảo tiếp xúc hoàn toàn giữa đầu dò và tế bào.
[Lưu ý]: Mật độ tế bào phải được điều chỉnh theo phương pháp phát hiện tiếp theo. Ví dụ, đối với phép đo lưu lượng tế bào, số lượng tế bào trong một ống không được nhỏ hơn 104/mL hoặc lớn hơn 106/mL.
e) Thu thập và rửa tế bào bằng cách ly tâm hai lần với môi trường không có huyết thanh để loại bỏ DCFH-DA tự do.
4. Phát hiện huỳnh quang và phân tích dữ liệu
Kính hiển vi huỳnh quang Đo lường: Thực hiện kính hiển vi tế bào sống với bộ lọc phù hợp với fluorescein (FITC) bằng kính hiển vi huỳnh quang. Đánh giá độ sáng của tế bào bằng mắt thường và so sánh giữa mẫu đối chứng và mẫu hoặc sử dụng phương pháp phân tích hình ảnh để so sánh tín hiệu giữa các bức ảnh kỹ thuật số của tế bào.
Đo lưu lượng tế bào: Các tế bào bám dính nên được thu thập bằng trypsin để chuẩn bị một hỗn dịch tế bào đơn lẻ; Đối với các tế bào hỗn dịch, các tế bào được thu thập trực tiếp. Lý tưởng nhất là nên phân tích 10.000 tế bào theo điều kiện thử nghiệm. Các tế bào không nên quá dày đặc trong quá trình thử nghiệm (<1 × 106 tế bào/mL). Loại trừ các mảnh vụn và cô lập quần thể tế bào quan tâm bằng gating. Sử dụng cường độ huỳnh quang trung bình, xác định sự thay đổi gấp giữa các mẫu đối chứng và mẫu đã xử lý với Ex/Em = 480/525 nm.
Đo vi mảng huỳnh quang: Đo ngay lập tức trên máy đọc đĩa huỳnh quang ở Ex/Em = 480/525 nm ở chế độ điểm cuối khi có môi trường. Trừ các giá trị đọc trắng khỏi tất cả các phép đo và xác định sự thay đổi gấp từ kiểm soát xét nghiệm.

Thận trọng

1. Rửa tế bào sau khi ủ với DCFH-DA để giảm nhiễu nền.
2. Nên đo huỳnh quang càng sớm càng tốt sau khi ủ để tránh những sai sót có thể xảy ra.
3. Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần khi thực hiện thao tác.
4. Chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu!