Puromycin là một loại kháng sinh aminoglycoside được sản xuất bằng quá trình lên men và chuyển hóa của Streptomyces alboniger, có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn Gram dương, nhiều loại tế bào động vật và côn trùng bằng cách ức chế tổng hợp protein. Puromycin có hiệu quả chống lại E. coli trong một số trường hợp. Cơ chế là thuốc puromycin là một chất tương tự của đầu 3´ của phân tử aminoyl-TrNA, có thể liên kết với vị trí A của ribosome và được đưa vào chuỗi peptide mở rộng. Sau khi puromycin liên kết với vị trí A, nó sẽ không tham gia vào bất kỳ phản ứng nào tiếp theo, dẫn đến kết thúc sớm quá trình tổng hợp protein và giải phóng các polypeptide chưa trưởng thành có chứa puromycin ở đầu C.

Gen pac được tìm thấy trong Streptomyces alboniger của vi khuẩn sản xuất puromycin mã hóa puromycin N-acetyltransferase (PAC), có thể mang lại khả năng kháng puromycin. Tính năng này hiện được áp dụng phổ biến để sàng lọc các dòng tế bào chuyển gen ổn định ở động vật có vú cụ thể mang plasmid mang gen pac.

Việc sử dụng chung puromycin trong sàng lọc chủng ổn định tế bào có liên quan đến đặc tính của các vectơ lentivirus và hầu hết các vectơ lentivirus thương mại hiện nay đều mang gen pac. Trong một số trường hợp cụ thể, puromycin cũng có thể được sử dụng để sàng lọc các chủng E. coli biến đổi mang plasmid gen pac.

Sản phẩm này là dung dịch hydrochloride puromycin vô trùng hòa tan trong nước cất, nồng độ 10 mg/mL (10 mg/mL trong H₂O), có thể pha loãng trực tiếp với môi trường nuôi cấy hoặc dung dịch đệm khác, thích hợp cho nuôi cấy tế bào, nồng độ làm việc thông thường là 1-10 µg/mL.

Ngoài ra, Yeasen công ty cũng cung cấp puromycin hydrochloride (mã số: 60210ES) ở dạng bột, ở trạng thái khác nhưng có cùng chức năng.

Đặc trưng

Độ tinh khiết≥98%

Vô trùng

Ứng dụng

Thích hợp cho nuôi cấy tế bào

Scác dòng tế bào chuyển gen ổn định đặc hiệu cho động vật có vú mang plasmid mang gen pac

Màn hình cái các chủng E. coli biến đổi mang plasmid gen pac

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Vận chuyển và lưu trữ

Các Puromycin (10 mg/mL trong dung dịch) sản phẩm nên được bảo quản ở nhiệt độ -15℃ ~ -25℃ vì 1 năm.

Hướng dẫn

1. Nồng độ làm việc được đề xuất

Tế bào động vật có vú: 1-10 μg/mL, nồng độ tối ưu cần được xác định bằng đường cong tiêu diệt.

Escherichia coli: Môi trường thạch LB được sử dụng để sàng lọc Escherichia coli được chuyển đổi ổn định với gen pac ở nồng độ 125 μg/mL.

Ghi chú: Việc sàng lọc các chủng E. coli ổn định bằng puromycin đòi hỏi phải điều chỉnh độ pH chính xác.

Nồng độ khuyến nghị của thuốc puromycin hydroclorua

2. Xác định thuốc puromycin đường cong tiêu diệt (lấy ví dụ về chuyển gen shRNA hoặc chuyển gen lentivirus)

Nồng độ sàng lọc hiệu quả của thuốc puromycin có liên quan đến loại tế bào, trạng thái tăng trưởng, mật độ tế bào, quá trình chuyển hóa tế bào và vị trí chu kỳ tế bào.Để sàng lọc các dòng tế bào shRNA biểu hiện ổn định, điều quan trọng là phải xác định nồng độ puromycin tối thiểu có thể tiêu diệt các tế bào chưa chuyển gen/chuyển gen. Khuyến cáo rằng những khách hàng thực hiện thí nghiệm lần đầu tiên nên thiết lập đường cong tiêu diệt phù hợp với hệ thống thí nghiệm của riêng họ.

1) Ngày 1: Đĩa 24 giếng được mạ ở mật độ 5-8×104 tế bào/giếng, và một số lượng đủ các giếng được mạ cho các thí nghiệm gradient tiếp theo. Các tế bào được ủ qua đêm ở 37℃.

2) Ngày 2: A) Chuẩn bị môi trường sàng lọc: môi trường mới chứa các nồng độ puromycin khác nhau (như 0-15 μg/mL, ít nhất 5 gradient); B) Thay thế môi trường sàng lọc mới chuẩn bị trong các tế bào sau khi ủ qua đêm; Sau đó, các tế bào được ủ ở 37℃.

3) Ngày 4: Thay môi trường chọn lọc mới và quan sát khả năng sống của tế bào.

4) Tùy thuộc vào tình trạng phát triển của tế bào, thay môi trường chọn lọc mới sau mỗi 2-3 ngày.

5) Các tế bào được theo dõi hàng ngày để quan sát tỷ lệ tế bào sống nhằm xác định nồng độ thuốc thấp nhất có hiệu quả tiêu diệt các tế bào không chuyển gen hoặc tất cả các tế bào không chuyển gen trong vòng 4-6 ngày kể từ khi bắt đầu sàng lọc bằng kháng sinh.

3. Sàng lọc các dòng tế bào động vật có vú được chuyển gen ổn định

Sau khi chuyển plasmid chứa gen pac, các tế bào được nhân lên trong môi trường có chứa puromycin để chọn ra các tế bào chuyển gen ổn định.

1) 48 giờ sau khi chuyển gen, các tế bào (ban đầu hoặc pha loãng) được nuôi cấy trong môi trường mới có chứa nồng độ puromycin thích hợp.

Ghi chú:Kháng sinh có hiệu quả nhất khi tế bào đang phân chia tích cực. Nếu tế bào quá dày đặc, hiệu quả của kháng sinh sẽ giảm đáng kể. Tốt nhất là nên cấy tế bào ở mật độ không quá 25%.

2) Loại bỏ và thay thế môi trường nuôi cấy có chứa thuốc puromycin mỗi 2-3 ngày.

3) Các ổ hình thành tế bào được đánh giá 7 ngày sau khi sàng lọc. Các tổn thương có thể cần thêm một tuần hoặc hơn, tùy thuộc vào dòng tế bào chủ và hiệu quả sàng lọc chuyển gen.

Lưu ý: Quan sát tình trạng tăng trưởng tế bào mỗi ngày. Việc sàng lọc puromycin cần ít nhất 48 giờ và thời gian sàng lọc nồng độ puromycin hiệu quả thường là 3-10 ngày.

4) Chuyển và đặt 5-10 dòng kháng thuốc vào đĩa Petri 35 mm và tiếp tục nuôi cấy với môi trường chọn lọc trong 7 ngày. Nuôi cấy làm giàu này là để chuẩn bị cho thí nghiệm độc tính tế bào trong tương lai.

Tài liệu:

Bảng dữ liệu an toàn

60209_MSDS_HB220420_EN.pdf

Hướng dẫn sử dụng

60209_Hướng dẫn sử dụng_HB250114_EN.pdf

Trích dẫn & Tài liệu tham khảo:

[1] Furge KA. et al., 2001. Ức chế khả năng gây ung thư và di căn do Ras trung gian thông qua ức chế thụ thể tyrosine kinase Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 là cần thiết trong các tế bào ung thư di căn để kích hoạt, di chuyển và xâm lấn Rac1 được tăng cường bởi Caveolin-1. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Kiểm soát tăng huyết áp dựa trên phần thưởng bằng giao diện não-dopamine tổng hợp. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotic BID là tác nhân ATM trong phản ứng tổn thương DNA. Tế bào. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) gây ra sự loại bỏ syndecan-1 (CD138) và syndecan-4 phụ thuộc vào CCR5 từ các tế bào và dạng HeLa.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. Protein bệnh máu nhiễm sắc tố di truyền, HFE, ức chế sự hấp thụ sắt thông qua việc điều hòa giảm Zip14 trong tế bào HepG2[J]. Tạp chí Hóa học Sinh học, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Phức hợp TSC1-TSC2 là cần thiết để kích hoạt đúng cách mTOR2[J]. Sinh học phân tử và tế bào, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDown-regulation của micro-RNA-1 (miR-1) trong ung thư phổi. Ức chế đặc tính sinh ung thư của tế bào ung thư phổi và sự nhạy cảm của chúng với apoptosis do doxorubicin gây ra bởi miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Tạp chí Hóa học Sinh học, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, và cộng sự. Sự tích hợp thực khuẩn Mu trong bộ gen của nấm men và động vật có vú [J]. Nghiên cứu Axit Nucleic, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. Một con đường cGAS-STING-PERK không điển hình tạo điều kiện cho chương trình dịch mã quan trọng đối với tình trạng lão hóa và xơ hóa cơ quan. Nat Cell Biol. 2022 tháng 5; 24 (5): 766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 ngày 2 tháng 5. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 trong các túi ngoại bào nhỏ có nguồn gốc từ HNSCC xác định tình trạng ức chế miễn dịch liên quan đến khối u được trung gian bởi các đại thực bào trong môi trường vi mô. J Extracell Vesicles. Tháng 5 năm 2022;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al. Xác định protease 32 đặc hiệu ubiquitin là một oncogen trong u nguyên bào thần kinh đệm và các cơ chế cơ bản. Sci Rep. 2022 ngày 19 tháng 4;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. Protein liên kết globulin tử cung 1 (UGRP1) liên kết với podoplanin (PDPN) để thúc đẩy một con đường viêm mới trong quá trình nhiễm Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022 tháng 6;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850.Mã số PM: 35652821; Mã số PM: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. Trục MORTALIN-Ca2+ thúc đẩy khả năng kháng rituximab bẩm sinh ở u lympho tế bào B lan tỏa lớn. Cancer Lett. 2022 ngày 1 tháng 7; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 ngày 18 tháng 4. PMID: 35447282.