Hygromycin B, một loại kháng sinh aminoglycoside được tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus, ức chế quá trình tổng hợp protein bằng cách can thiệp vào quá trình chuyển vị ribosome 70S và gây ra sự đọc sai khuôn mẫu mRNA, do đó tiêu diệt sinh vật nhân sơ (như vi khuẩn), sinh vật nhân chuẩn (như nấm men, nấm) và sinh vật nhân chuẩn ở động vật có vú bậc cao.

Gen kháng Hygromycin (hyg hoặc hph) có nguồn gốc từ Escherichia coli mã hóa hygromycin B phosphotransferase, giải độc hygromycin B thành sản phẩm phosphoryl hóa không có hoạt tính sinh học, khiến nó trở thành một dấu hiệu chọn lọc tuyệt vời để sàng lọc và nuôi cấy tế bào nhân sơ hoặc nhân thực được chuyển gen thành công với gen kháng hytromycin. Ngoài ra, do các chế độ hoạt động khác nhau, Hygromycin B thường được sử dụng kết hợp với G418 hoặc Blasticidin S để lựa chọn dòng tế bào kháng kép. Hygromycin B cũng có thể được sử dụng như một tác nhân kháng vi-rút vì nó xâm nhập chọn lọc vào các tế bào có tính thấm màng tăng do nhiễm vi-rút và ức chế quá trình dịch mã. Nó cũng có thể hoạt động như một chất xua đuổi côn trùng thông qua việc trộn với thức ăn chăn nuôi.

Ngoài ra, Yeasen công ty cũng cung cấp Hygromycin B (mã số: 60224ES) dưới dạng dung dịch, ở trạng thái khác nhưng có cùng chức năng.

Đặc trưng

Sản xuất chuẩn hóa, sử dụng chế độ sản xuất hàng loạt tại nhà máy

Ứng dụng

Sàng lọc các dòng tế bào được chuyển gen ổn định

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Vận chuyển và lưu trữ

Các Hygromycin B sản phẩm nên được lưu trữ tại -15℃ ~ -25℃ vì 2 năm.

Hướng dẫn

1. Chuẩn bị dung dịch gốc (50 mg/mL)

Cân 0,5 g Hygromycin B và thêm vào 10 mL dung dịch 1×PBS, pH 7,4. Sau khi hòa tan hoàn toàn, lọc qua 0,22 μm lọc để khử trùng. Chia thành các thể tích nhỏ để sử dụng một lần (ví dụ: 1 mL) và bảo quản ở nhiệt độ -25 đến -15℃hoặc 2 ĐẾN 8℃.

2. Nồng độ sàng lọc thường dùng

Nồng độ làm việc của hygromycin B được sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển giao ổn định cần thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, môi trường, điều kiện tăng trưởng và tốc độ trao đổi chất của tế bào, với nồng độ khuyến nghị là 50-1000 μg/mL. Đối với hệ thống thử nghiệm đầu tiên, đường cong tiêu diệt (đường cong tiêu diệt), đường cong phản ứng liều lượng, được khuyến nghị để xác định nồng độ sàng lọc tối ưu.

Nhìn chung, tế bào động vật có vú: 50-500 μg/mL; Tế bào vi khuẩn/thực vật: 20-200 μg/mL; Nấm: 300-1000 μg/mL.

3. Thiết lập đường cong giết chết

Lưu ý: Để sàng lọc các dòng tế bào ổn định, cần xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu có khả năng tiêu diệt các tế bào chủ chưa chuyển gen. Có thể đạt được điều này bằng cách thiết lập đường cong tiêu diệt (đường cong liều lượng-đáp ứng). Cần sắp xếp ít nhất năm nồng độ.

1) Ngày 1: Các tế bào chưa chuyển gen được đặt trong đĩa nuôi cấy thích hợp với mật độ tế bào 20-25% và nuôi cấy qua đêm.

Lưu ý: Có thể tăng lượng tế bào tiêm chủng đối với các tế bào cần mật độ cao hơn để phát hiện sức sống.

2) Thiết lập nồng độ gradient trong phạm vi thích hợp theo loại tế bào.Tế bào động vật có vú có thể thiết lập 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Pha loãng dung dịch Hygromycin B 1:10 với nước khử ion hoặc đệm PBS thành 5 mg/mL. Sau đó pha loãng dung dịch thành nồng độ làm việc tương ứng theo bảng sau.

3) Ngày 2: Thay thế bằng môi trường mới chuẩn bị có chứa nồng độ thuốc tương ứng. Làm ba mẫu song song cho mỗi nồng độ.

4) Sau đó thay môi trường mới có chứa thuốc sau mỗi 3-4 ngày.

5) Tiến hành đếm tế bào sống theo các khoảng thời gian cố định (chẳng hạn như cứ sau 2 ngày) để xác định nồng độ thích hợp ức chế sự phát triển của các tế bào chưa chuyển gen. Chọn nồng độ thấp nhất có thể tiêu diệt phần lớn các tế bào trong số ngày lý tưởng (thường là 7-10 ngày) làm nồng độ làm việc để lựa chọn chất chuyển gen ổn định.

4. Sàng lọc các dòng tế bào động vật có vú được chuyển gen ổn định

1) 48 giờ sau khi chuyển gen, các tế bào được nuôi cấy lại bằng môi trường sàng lọc có chứa hygromycin B ở nồng độ thích hợp (trực tiếp hoặc pha loãng).

Lưu ý: Thuốc kháng sinh có tác dụng tốt nhất đối với các tế bào đang phân chia tích cực. Nếu các tế bào quá dày đặc, thuốc kháng sinh sẽ không tiêu diệt được các tế bào. Phân chia các tế bào sao cho các tế bào không quá 25% hợp lưu.

2) Thay môi trường sàng lọc sau mỗi 3-4 ngày.

3) Đo sự hình thành khuẩn lạc tế bào sau 7 ngày sàng lọc. Sự hình thành khuẩn lạc có thể mất thêm một tuần hoặc lâu hơn, tùy thuộc vào loại tế bào chủ, quá trình chuyển gen và hiệu quả sàng lọc.

4) Chọn 5-10 dòng kháng thuốc và chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm, nuôi cấy với môi trường sàng lọc có chứa thuốc trong 7 ngày.

5) Thay môi trường mới không có thuốc để nuôi cấy.

Tài liệu:

Bảng dữ liệu an toàn

60225_MSDS_HB220420_EN.pdf

Hướng dẫn sử dụng

60225_Hướng dẫn sử dụng_HB250115_EN.pdf