Aureobasidin A, còn được gọi là AbA, Basifungin, breomycin A, là một kháng sinh peptide este vòng được phân lập từ nấm sợi Aureobasidium Pullulans số R106. Nó có khả năng chống nấm mạnh và là chất ức chế inositol phosphorylated ceramide synthase AUR1. Nó độc với nấm men ngay cả ở nồng độ thấp hơn (0,1-0,5 μg/mL). Các loài nấm nhạy cảm với Aureobasidin A bao gồm Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans và A. niger. Các loài nấm nhạy cảm với nó bao gồm nấm men răng (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces kê (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) và Aspergillus niger (A. niger.). Cơ chế hoạt động là Aureobasidin A ức chế hoạt động của inositol phosphoramidite (inositol phosphorylceramide, IPC) synthase, mà sự phát triển của nấm phụ thuộc vào, và can thiệp vào quá trình tổng hợp sphingolipid, do đó tiêu diệt thêm chủng. Nhiều gen mã hóa IPC synthase đã được nghiên cứu như gen AUR 1 từ Saccharomyces cerevisiae và gen AURA từ A. sinensis, có tính đồng dạng. Việc làm bất hoạt các gen mã hóa này khiến các chủng kháng Aureobasidin A, chẳng hạn như gen AUR 1-C.

Aureobasidin A rất phù hợp làm chất đánh dấu chọn thuốc để sàng lọc các dòng vô tính dương tính. Kháng Aureobasidin A cũng là chất báo cáo lý tưởng trong các nghiên cứu lai đơn và lai đôi trên nấm men. Sản phẩm này là dung dịch Aureobasidin A hòa tan trong methanol với nồng độ 1 mg/mL.

Đặc trưng

Độ tinh khiết≥97%

Sản xuất chuẩn hóa, sử dụng chế độ sản xuất hàng loạt tại nhà máy

Ứng dụng

Nghiên cứu lai hai loại nấm men

Nghiên cứu lai một loại nấm men

Dấu hiệu lựa chọn thuốc men nghiêm ngặt

Kháng Aureobasidin A là một chất báo cáo lý tưởng cho các nghiên cứu lai tạo nấm men

Thông số kỹ thuật

Thành phần

Vận chuyển và lưu trữ

Các Aureobasidin A（AbA) sản phẩm nên được lưu trữ tại -15℃ ~ -25℃ vì 2 năm.

Hướng dẫn

1. Tập trung làm việc

Vui lòng tham khảo tài liệu có liên quan để biết nồng độ cụ thể và khám phá cũng như tối ưu hóa theo các điều kiện thử nghiệm của riêng bạn (như mục đích thử nghiệm, loại tế bào, đặc điểm nuôi cấy, v.v.)

2. Thí nghiệm tế bào (thí nghiệm trong ống nghiệm)

Aureobasidin A ngăn chặn sự phát triển của tế bào nấm men thông qua cả tình trạng nhiễm độc ceramide và sự thiếu hụt inositolphosphorylceramides thiết yếu^[1].

Các đoạn lặp lại ba tandem của mỗi mô típ hộp CArG đã được tổng hợp. Tất cả các đoạn DNA đã được nhân bản vào vectơ Y1H pAbAi (Clontech, Mountain View, Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng các vị trí hạn chế phù hợp. Sau đó, mỗi cấu trúc pAbAi đã lắp ráp được tuyến tính hóa bằng BstbI và chuyển đổi thành chủng Saccharomyces cerevisiae Y1HGold theo Sổ tay Hệ thống chuyển đổi nấm men 2 (Clontech, Mountain View, Hoa Kỳ). Các đoạn DNA mang đoạn DNA mong muốn đã được sàng lọc để tự kích hoạt trên môi trường loại bỏ uracil tổng hợp bổ sung Aureobasidin A ở nồng độ 100–900 ng/mL, như đã chỉ ra (Clontech, Mountain View, USA)^[2].

Khung đọc mở (ORF) của gen SlBES1 được khuếch đại và gắn vào plasmid pGBKT7-GAL4BD. Các cấu trúc GAL4BD-SlBES1 hợp nhất được chuyển đổi thêm thành tế bào nấm men Y2H Gold. SD/−Các đĩa môi trường Trp được sử dụng để nuôi cấy các chủng nấm men biến đổi.Các αHoạt động của -galactosidase của các thể chuyển đổi được xác định bằng X-α-gal và biểu hiện của AUR1-C được sàng lọc bằng Aureobasidin A^[3].

3. Nồng độ ức chế tối thiểu của Aureobasidin đối với nhiều loại nấm men khác nhau

4. Quy trình vận hành (đối với hệ thống chuyển đổi nấm men kháng AbA)

1) Thêm 0,5 mL môi trường nuôi cấy nấm men qua đêm vào 50 mL môi trường YPD (thành phần: 1 L môi trường lỏng chứa 10 g chiết xuất nấm men, 20 g polypeptone, 20 g D-glucose; đối với môi trường rắn, thêm 2% agar).

2) Ủ ở nhiệt độ 30℃ trong khoảng 6 giờ, cho đến khi OD660 là 1-2. Khi sử dụng lưỡng bội, đo OD660 là 2-4.

3) Ly tâm ở 1.000×g trong 5 phút.

4) Tái huyền phù viên trong 10 mL dung dịch A (thành phần: 100 mM Lithium acetate, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA), sau đó ly tâm ở 1.000×g trong 5 phút.

5) ENgâm viên trong dung dịch A cho đến khi OD660 đạt 150.

6) Lấy 100 µL dung dịch tế bào vào ống nghiệm và ủ ở 30℃ trong 1 giờ.

7) Thêm 5 µg vector (DNA tròn hoặc DNA tuyến tính) và 150 µg DNA mang (đã được đun nóng ở 100℃ trong 10 phút rồi nhanh chóng làm nguội).

Lưu ý: pAUR101 cần DNA tuyến tính để chuyển đổi. Sử dụng DNA vòng sẽ làm giảm hiệu quả chuyển đổi hoặc thậm chí có thể thất bại. pAUR112 và pAUR123 cần DNA plasmid hoàn chỉnh để chuyển đổi.

8) Thêm 850 µL dung dịch B (thành phần: hòa tan 40 g Polyethylene Glycol 4000 trong 100 mL dung dịch A và trộn đều, chuẩn bị tươi trước khi sử dụng) và trộn nhẹ nhàng.

9) Ủ ở nhiệt độ 30℃ trong 30 phút, sau đó ở 42℃ trong 15 phút.

10) Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

11) Ly tâm ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 1 phút và tái huyền phù cặn trong 5 mL môi trường YPD.

12) Ủ ở nhiệt độ 30℃ trong vòng 6 giờ hoặc qua đêm.

13) Ly tâm ở tốc độ 5.000-10.000 vòng/phút và tái huyền phù viên trong 1-10 mL NaCl 0,9%.

14) Đặt 100 µL dung dịch huyền phù tế bào lên đĩa môi trường chọn lọc YPD (chứa nồng độ AbA nhất định, tùy thuộc vào loại chủng).Ủ ở nhiệt độ 30℃ trong 3-4 ngày cho đến khi quá trình chuyển đổi hoàn tất.

15) Chọn các thể chuyển đổi dương tính và/hoặc xác định hiệu quả chuyển đổi (thể hiện bằng số lượng khuẩn lạc được chuyển đổi trên mỗi microgam DNA plasmid).

Tài liệu:

Bảng dữ liệu an toàn

60231_MSDS_HB220420_EN.pdf

Hướng dẫn sử dụng

60231_Hướng dẫn sử dụng_HB250116_EN.pdf

Các con số

Hình 1. Biểu đồ tăng trưởng của đĩa nấm men

Căng thẳng thử nghiệm:GS115

Lượng sử dụng: 0,05 μg/mL、0,1 μg/mL、0,5 μg/mL、1 μg/mL

Sự đối đãi: 3-5 Ngàys ở 30℃

Hàng trên cùng là Yeasen sản phẩm và hàng dưới là thương hiệu T*.