您对“全能” DNase i ?有多少了解

脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) 是一种非特异性的内切酶，能够消化单链 （单链DNA） 和双链 DNA （dsDNA）。它水解磷酸二酯键，产生具有 5'-磷酸基团和 3'-OH 基团的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。DNase I 活性的最佳 pH 范围是 7-8，其活性依赖于 Ca2+ 并可被二价金属离子（如 Mn）活化2+, 镁2+, 锌2+等在Mg存在下2+，DNase I 可随机切割任意位点的双链 DNA。在 Mn2+，DNase I 可以在同一位点切割双链 DNA，产生平末端或带有 1-2 个核苷酸突出的粘性末端。

图 1. DNase I 在 Mg 存在下切割 dsDNA 的示意图2+ 和锰2+

常见的DNase I主要来源于牛胰腺纯化或重组酶，与牛胰腺纯化的DNase I相比，重组DNase I内源性RNase含量相对较低或可制成无RNase产品，更适合对RNase敏感的应用，如从RNA样本中去除DNA。

应用

在应用方面，DNase I 以其在维持 RNA 完整性相关实验中的应用而闻名，例如提取不含 DNA 的 RNA、在逆转录前制备不含 gDNA 的 RNA 模板以及在体外转录后降解 DNA 模板。此外，它还可用于消化 rRNA 去除中的 DNA 探针、通过缺口平移进行 DNA 标记、使用足迹法分析 DNA-蛋白质相互作用、生成随机 DNA 文库、降低细胞裂解物或蛋白质提取物的粘度、消化细胞粘附物作为细胞培养中的添加剂以及部分切割基因组 DNA 作为 TUNEL 检测细胞凋亡的阳性对照。总之，DNase I 几乎可用于任何需要酶消化 DNA 的应用。下面将简要介绍几种常见的应用。

  • RNA 提取或逆转录前去除 gDNA

RNA作为实验室中研究较为常见的样本，其本身的质量对实验数据的质量影响极大。在RNA提取过程中，一般无法完全避免gDNA的残留。因此，在进行具有挑战性的下游应用（如mRNA表达分析、转录组分析等）之前，通常建议用DNase I处理RNA样本，以消化残留的gDNA。gDNA的消化可以在RNA提取过程中进行，也可以在RNA提取后进行，还可以在RNA逆转录前进行。

图 2. 基于 DNase I 的 gDNA 去除过程

  • 体外转录中模板 DNA 的去除

体外转录（IVT）主要以DNA为模板，在适当的底物和缓冲液的作用下生成RNA。此过程中常用的RNA聚合酶包括T7、T3和SP6，它们负责催化RNA合成。然而，合成的RNA产物可能含有DNA残基，消除这些残基有利于下游实验。

尤其是在mRNA疫苗的研发过程中，去除这些DNA残留是关键的一步，直接影响后续纯化过程的难度和最终产品的纯度。为了有效消除模板DNA，通常使用DNase I进行处理，确保RNA样本中不含DNA残留，有助于提高实验整体的准确性和效率。

图3：以线性化质粒为模板的体外转录过程[4]

  • RNA 文库构建和测序中的 rRNA 去除

生物体中rRNA含量丰富，保守性较高，对于生物信息研究意义不大，但实验过程中提取的总RNA中95%为人类rRNA，这些rRNA的存在可能会干扰目标RNA的检测，因此在RNA文库制备和测序过程中，通常先去除rRNA，目前去除rRNA的主要方法是RNAase消化，其主要操作步骤为： 步骤和原则如下：

  1. 提取总RNA；
  2. 将单链DNA探针与rRNA分子杂交（注：设计和合成rRNA特异性单链DNA探针）；
  3. RNase H降解杂交的rRNA；
  4. DNase I 降解 DNA 探针；
  5. rRNA 被成功去除，留下非 rRNA RNA 模板。

图4：基于酶法的rRNA去除原理示意图[5]

  • DNA 标记的缺口平移

缺口平移是实验室中最常用的标记脱氧核糖核酸探针的方法。该方法是通过 DNase I 和 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I。

主要原理如下：

  1. 首先，使用适当浓度的 DNase I 在待标记的双链 DNA 的每条链上制造多个单链缺口，在缺口部位形成 3' 羟基末端。
  2. 然后，利用 5'→3' 核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA 聚合酶 I 去除切口 5' 端的一个核苷酸，而 5'→3' 聚合酶活性 E. 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 将标记的核苷酸引入缺口的 3' 端以进行修复。随着缺口沿着 DNA 链移动，标记的核苷酸被整合到新合成的 DNA 链中。

图5：缺口平移法DNA标记原理示意图[6]

  • DNase I 足迹分析实验

DNase I 足迹分析是一种精确识别 DNA 分子上 DNA 结合蛋白结合位点的方法。其原理是与 DNA 片段结合的蛋白质保护结合区域不被 DNase I 降解。酶消化后，剩余的片段（“足迹”）可用于确定其序列。在凝胶图像中，没有与蛋白质结合区域相对应的条带。

主要原理如下：

  1. 标记待测试的双链 DNA 分子的单链末端。
  2. 将蛋白与DNA混合，加入适量DNase I进行酶切，形成不同长度的DNA片段。应控制酶的量以确保相邻的 DNA 片段仅相差一个核苷酸，并且应平行包括不添加蛋白质的对照。
  3. 从DNA中去除蛋白质，用PAGE电泳分离变性的DNA，放射自显影，通过与对照组的比较，解释足迹区域的核苷酸序列。

图6：DNase I足迹分析原理示意图[7]

这 脱氧核糖核酸酶 选择指南 Yeasen

为了满足各种应用需求， Yeasen 提供 重组 脱氧核糖核酸酶 在 大肠杆菌，并可提供GMP级的DNase I，满足mRNA体外转录等应用的要求。

产品定位

应用

产品名称

目录编号

无 RNase

从 RNA 和蛋白质制剂中去除 DNA

重组 DNase I（无 RNase）

10325ES

GMP级， 无 RNase

mRNA体外转录

UCF.ME® 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) GMP 级

10611ES

参考

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L 等。头颈癌中HPV DNA、E6/E7 mRNA及p16INK4a检测：系统评价与荟萃分析[J]。《柳叶刀肿瘤学》2014, 15(12): 1319-1331。

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S 等. 宫颈样本中致癌HPV型特异性病毒DNA载量与E6/E7 mRNA检测的比较：多中心研究结果[J]. 医学病毒学杂志, 2013, 85(3): 472-482。

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky LS. 优化DNA酶I从RNA中去除污染DNA以用于定量RNA-PCR[J]. 生物技术, 1996, 20(6): 1012-1020。

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. 体外转录 mRNA（IVT mRNA）在临床应用方面的进展[J]. 先进药物输送评论，2023，199：114961。

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R 等。DNase I不可逆热失活而不引起RNA降解[J]。生物技术，2000，29(2): 252-256。

[6] Adolph S, Hameister H. 利用生物素标记的 d-UTP 进行中期染色体的原位缺口平移[J]. 人类遗传学, 1985, 69: 117-121。

[7] 宋晨, 张胜, 黄华. 选择合适的方法识别微生物基因组中的复制起点。 前沿微生物学，2015，6：1049。

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