等温扩增技术可在恒温条件下实现扩增特定核酸序列的目的，具有无需特殊设备、扩增时间短、灵敏度高等特点，在现场检测和即时诊断中展现出良好的应用前景，非常适合分子诊断工具的开发。

在新冠病毒疫情形势严峻、毒株增多、传染性增强的背景下，恒温扩增技术可快速检测新冠病毒 用简单的仪器快速检测，有助于解决传统PCR技术检测时间长、对检测设备和试剂要求高导致部分新冠肺炎患者无法快速确诊的问题。 那么等温扩增技术RT-LAMP的原理是什么？需要哪些优质原料？ Yeasen 可以提供吗？

1、RT-LAMP的原理是什么？
2. RT-LAMP 的引物设计
3. 哪些原料可以 Yeasen 提供？
4. 产品选型指南

1、RT-LAMP的原理是什么？

2000年日本学者Notomi等建立了一种新的核酸扩增技术，称为环介导等温扩增（LAMP）。LAMP采用针对目的基因6个区域设计4条特异性引物，利用链置换型DNA聚合酶，在等温条件下（60～65℃）数十分钟内扩增出109个目的序列拷贝数。用琼脂糖凝胶电泳法判断结果，阳性结果呈阶梯状条带。LAMP具有特异性强、灵敏度高、操作快速简便、成本低廉等特点。随着该技术的不断改进和完善，目前已用于各种病原微生物的检测。

RT-LAMP是在LAMP扩增体系中加入逆转录酶的方法，可实现对病毒RNA的直接检测。LAMP的扩增效率极高，仅用少量的cDNA就能扩增出大量的核酸。节省了核酸扩增过程中逆转录的时间，加快了RNA的检测速度。

DNA在65℃左右处于动态平衡状态，在链置换DNA聚合酶的作用下，从FIP引物的F2段3’端开始，与模板DNA的互补序列配对，引发链置换DNA合成。F3引物在F2c前端与F3c互补，以3’端为起点合成其DNA，同时在链置换DNA聚合酶的作用下，替换前导FIP引物合成的DNA链向前延伸。最终的F3引物合成的DNA链与一条模板DNA链形成双链，FIP引物合成的DNA链被F3引物链替换，生成单链，此单链在5’端具有互补的F1c和F1段，因而进行自身碱基配对，形成环状结构。并且将BIP引物与单链杂交结合，并以BIP引物的3’端为起点合成互补链，在此过程中结构被打开。然后从BIP引物中插入类似于F3和B3的引物，进行碱基互补配对，从3’端为起点合成一条新的互补链。被替换的单链DNA两端均有互补序列，并发生自身碱基配对，形成环状结构，因此整条链呈现哑铃状结构。此结构即为RT-LAMP方法扩增循环的起始结构。

哑铃型结构中，DNA延伸是以3’端的F1片段为起点，以其自身为模板进行的，而FIP引物F2与环上的单链F2c杂交，启动新一轮的链置换反应。由F1片段合成的双链核酸解离，同样在核酸上形成环状结构。环状结构上有单链形式的B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，经过同样的过程形成环状结构。按照此过程，同一条链上的互补序列循环配对、链延伸，最终形成不同大小的结构。

2. RT-LAMP 的引物设计

引物设计是RT-LAMP成功扩增和检测的关键。RT-LAMP引物包括两个外引物（F3和B3）和两个内引物（FIP和BIP）。F3引物：上游外引物，由F3区组成，与目的基因的F3c区互补。FIP引物：上游内引物，由F2区组成，F2区中目的基因3'端的F2c区与目的基因5'端的F1c区互补。BIP引物：下游内引物，由B2区组成，B2区与目的基因3'端的B2c区互补，且与目的基因5'端的B1c区具有相同的序列。

与PCR类似，引物设计原则应考虑碱基组成、GC含量、亚结构等因素。此外，还应注意以下几点：内引物FIP和BIP的5’端部分，即F1c和B1c，长度一般为8-50bp，长度优选为15-25bp，其Tm值大于F2和B2在3’端部分的Tm值。内引物FIP和BIP的3’端部分，即F2和B2，长度一般为8-50bp，长度优选为15-25bp，其Tm值与实验所选用的Bst DNA聚合酶的最适温度一致。外引物F3和B3的长度一般为8-50bp，长度优选为15-25bp，其Tm值小于F2和B2。设计引物时需考虑环状结构和靶序列的大小，当环状碱基数大于40bp、靶序列大小为130～200bp时扩增效率最高。

3. 哪些原料可以 Yeasen 提供？

3.1【全新升级】 Yeasen 布施 加 DNA 聚合酶

新升级的 Hieff™ Bst Plus DNA 聚合酶 （货号：14402ES、14403ES） 是通过表达和纯化嗜热芽孢杆菌的DNA聚合酶基因获得的 斯普 缺乏大肠杆菌中的 5′→3′ 外切酶结构域。该酶链置换能力强，具有灵敏度高、扩增效率高、dUTP耐受性高等优点，可广泛应用于基于等温扩增技术的病原体实时检测。

3.1.1 快速、高灵敏度

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase灵敏度高，可检测低至5拷贝的目的基因，模板量为飞克（fg）级别，扩增速度比竞争产品更快。

图 1. RT-LAMP 反应采用 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA 聚合酶（橙色）以及竞争对手 N（灰色）和竞争对手 T（蓝色）的 Bst 酶扩增 SARS-CoV-2。结果表明 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase总是能够比竞争产品更快达到阈值，并且扩增速度更快。

4. 产品选型指南

提供的产品 Yeasen 如下：

表 1.产品信息