双块抗TAQ DNA聚合酶抗体可帮助减少非特异性扩增

分子诊断是IVD领域中发展最快的子领域，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点，广泛应用于肿瘤伴随诊断、传染病和遗传病的筛查。在分子诊断领域，PCR不仅是最成熟、市场份额最大的技术平台，更是临床诊断的“金标准”技术。在传统的PCR反应中，经常会出现非特异性扩增的问题。非特异性扩增直接影响检测结果的解释，会导致扩增灵敏度的下降，甚至导致目标片段的产率下降。非特异性扩增是如何产生的，又该如何有效避免呢？

1. 常规 DNA 聚合酶可导致非特异性扩增

2. 热启动聚合酶可提高扩增特异性

3. 双阻断Taq抗体可双倍提高扩增特异性和稳定性

4. 业绩展示 Yeasen双块 Taq 抗体

5. 产品信息

1. 常规 DNA 聚合酶可导致非特异性扩增

引物序列特异性差是造成非特异性扩增的直接原因，作为常规DNA聚合酶的启动子，其外切酶活性可以在PCR体系的制备过程中截断DNA引物序列，降低引物的特异性。

此外，常规DNA聚合酶不仅具有外切酶活性，还具有聚合酶活性，虽然DNA聚合酶的最适延伸温度为72℃，但在室温下聚合酶仍有活性，因此在PCR反应体系的制备和初始加热过程中，引物可能与某些单链模板形成非特异性结合并在Taq DNA聚合酶作用下发生延伸，导致非目标序列的扩增，影响反应的特异性。

因此经常在冰上配置PCR体系以抑制DNA聚合酶的活性，此方法虽然简单、廉价，但不能完全抑制酶活性，因而不能消除非特异性产物的扩增。

2. 热启动聚合酶可提高扩增特异性

热启动聚合酶是热启动PCR的核心部件，在室温下，DNA聚合酶的活性位点被酶修饰剂封闭，只有经过95℃PCR变性后，酶修饰剂才脱落，启动酶活性，避免了酶引起的非特异性扩增。

目前市场上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学法、配体法、抗体法等，其中抗体修饰热启动聚合酶阻断效果最好，且酶活性释放速度快，可以大大缩短PCR反应时间，是IVD市场广泛应用的热启动酶修饰方法。

但需要注意的是，传统的抗体热启动方法只是阻断了Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性，只能防止低温下因错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。但如前所述，Taq DNA聚合酶不仅具有5'→3'聚合酶活性，还具有5'→3'外切酶活性，该外切酶活性在低温下可能导致错配的探针或其他物质降解，从而产生一些非特异性信号。

3. 双阻断Taq抗体可双倍提高扩增特异性和稳定性

作为国内分子酶行业的创新领军者， Yeasen 生物技术（上海）有限公司（以下简称 Yeasen）专注于分子酶原料研发生产，勇于创新，依托自身成熟的抗体筛选平台，以Taq DNA聚合酶为靶分子进行阻断抗体筛选，经过多年潜心研究和体系优化，开发出 双阻断抗Taq DNA聚合酶抗体，既可以阻断Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，又可以阻断Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性，双管齐下，既可以有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，又可以防止材料降解产生非特异性信号，成倍提高试剂的稳定性。

4. 性能展示 Yeasen双块 Taq 抗体

4.1 使用双阻断Taq抗体准确、灵敏度更高

阻断 Taq 聚合酶后 Yeasen双阻断抗体 及T公司抗体，对阳性样本采用ARMS-PCR进行检测。

图1. ARMS-PCR扩增曲线； 蓝色：T公司的阻断抗体； 红色的： Yeasen双阻断抗体

从图1可以看出，Taq聚合酶被 Yeasen的双阻断抗体在ARMS-PCR扩增中分型准确、灵敏度更高。

4.2 双阻断Taq抗体有效 阻断 Taq DNA 聚合酶的核酸外切酶活性

将合成的引物探针分别与未封闭和双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶反应液匹配,在40℃下反应,检测它们的荧光信号。

图2.双阻断抗体对外切酶活性的阻断效率检测； 黄色：未封闭的Taq DNA聚合酶组； 紫色：被双阻断抗体阻断的 Taq DNA 聚合酶组

从图2可以看出 双阻断抗体可以有效阻断Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性。

4.3双阻断Taq抗体可有效提高检测试剂的稳定性

分别用传统封闭抗体和双封闭抗体封闭Taq DNA聚合酶,配置成含有引物探针的全预混液,分别在4℃下扩增10 d和37℃下扩增1、3、5 d,观察扩增曲线和Ct值变化,比较传统封闭抗体和双封闭抗体对全预混反应液稳定性的影响。

图 3.传统封闭抗体（a）和双封闭抗体（b）封闭反应液扩增10000拷贝ASF质粒的扩增曲线； 蓝色：4℃保存10天； 红色：4℃放置0天（对照）

从图3可以看出双阻断抗体比传统阻断抗体更能保持反应液的稳定性，有效提高检测试剂的稳定性，含有引物探针的全量预混液经双阻断抗体阻断后，在4℃放置10天，扩增曲线和Ct值无明显变化。

图4.传统封闭抗体（a）和双封闭抗体（b）封闭反应液扩增10000拷贝ASF质粒的扩增曲线； 蓝色：37℃保存5天； 绿色：37℃，持续3天； 黄色：37℃，1天； 红色：37℃放置0天（对照）

从图4可以看出双阻断抗体比传统阻断抗体更能保持反应液的稳定性，有效提高检测试剂的稳定性。双阻断抗体对含有引物-探针的整个预混液进行阻断，在37℃放置1、3、5天后Ct值差异均小于0.2。

4.4 双阻断Taq抗体有助于解决基线漂移问题

当某些引物与特定的缓冲液和仪器配合时，会出现基线漂移。 Yeasen 尝试了多种方法改善基线问题，发现双阻断抗体更有利于基线稳定。

图5. N基因（a）和ACT基因（b）的扩增曲线； 红色：传统阻断抗体； 绿色：双阻断抗体

从图5可以看出，在特定的引物和缓冲液下使用双阻断抗体有助于解决基线漂移的问题。

4.5 使用双阻断 Taq 抗体获得良好的线性

用双封闭抗体封闭的反应液分别扩增100000、10000、1000、1000、100个拷贝的ASF/ACT双质粒，制作标准曲线。

图6 双阻断反应液制备ASF基因（a）和ACT基因（b）标准曲线

从图6可以看出，标准曲线R2 ASF基因的灵敏度为0.998，扩增效率为98.848%；标准曲线R2 ACT基因的PCR扩增产物阳性率为0.998,扩增效率为98.113%。

4.6 双阻断 Taq 抗体能快速释放酶活性

用进口T公司抗体封闭Taq聚合酶， Yeasen的双阻断抗体（cat#31303） 分别对31303和31303抗体进行酶活力检测，95℃热休克20s后检测酶活力，可见31303在95℃热休克20s后能释放95%以上的酶活力，与T公司抗体相当。

表 1. 酶活性

4.7 双阻断 Taq 抗体 可以阻断多种类型的 Taq 酶

三种 Taq 酶（野生型和 2 种突变型）被阻断 Yeasen双阻断抗体(cat#31303)，阻断比例为1μg:5U，测定荧光值及封闭效率。可以看出， Yeasen的双阻断抗体（cat#31303）更适合不同类型的Taq酶。

表2. 不同类型Taq酶的阻断效率

4.8 Yeasen的 双阻断 Taq 抗体在小鼠体内没有基因组残留

以水为阴性对照模板、以小鼠基因组为阳性对照模板，对31303个不同批次样品进行扩增，发现样品中未扩增出目的片段，说明抗体中无小鼠基因组残留。

图7. 小鼠基因组残留检测图

注：-为阴性对照，+为阳性对照，1-5为不同批次的31303个样品

5. 产品信息