如何选择您的NGS适配器？
NGS Adapter是新一代测序文库的重要组成部分，起到连接待测DNA片段与Flow cell（测序芯片）的作用，接头的效率是决定文库质量和产量的重要因素。那么什么是NGS Adapter？NGS Adapter的常见类型有哪些？如何为自己的测序平台选择合适的NGS Adapter？
1.什么是NGS Adapter？
2. 选择NGS指标需要考虑哪些因素？
3、常见的指数类型有哪些？
4. NGS适配器有哪些常见类型？
- UMI 适配器
- 完整适配器
- 适配器不完整
- Tn5 适配器
5. 如何为您的测序平台选择合适的NGS适配器？
6. 关于阅读
1.什么是NGS Adapter？
NGS Adapter是测序中的一系列适配器，是一段已知序列的短核苷酸序列，连接在目标核酸片段的两端，测序时通过与Flow cell上已知序列杂交开始测序，将文库结合到芯片上。那么NGS适配器的结构是怎样的呢？
以Illumina平台为例，一个NGS适配器可以分为三个部分：
P5和P7：与Flow cell上的P5和P7端结合的序列，将文库固定在测序芯片上，以便通过Bridge-PCR进行成簇反应。
Rd1 SP 和 Rd2 SP（Read1/Read2 测序引物）：测序引物的结合区域，指示序列开始读取的位置。
Index（又称barcode）：一段已知的合成序列，用于在混合文库测序中区分不同的样本。
如图。 1 Illumina平台单索引文库
如图。 2 MGI平台单端索引库
随着测序通量的提升，可以同时对多个样本进行测序，如何区分不同的样本就显得尤为重要。前面提到，NGS adapter的index序列是用于区分不同样本的，那么在NGS中，选择index序列需要考虑哪些因素呢？请继续阅读...
2. 选择指数时应考虑哪些因素？
标签长度一般为6nt-18nt，根据标签数目分为单标签和双标签，双标签位于待测片段的两端，选择标签组合时需考虑碱基平衡和荧光平衡。
基数平衡是指多个指数之间的平衡，而非单个指数内的基数平衡，需要从基数类型和基数分布两个方面考虑。 组合原则是：同一组指标中的A/T/C/G四个碱基需要纳入，且这四个碱基的比例接近，分别占25%左右。
荧光信号平衡是指在无法保证碱基平衡的情况下，选择保证荧光信号的平衡。在Illumina平台的4通道测序仪中，dG/dT标记的是绿色荧光，dC/dA标记的是红色荧光。 测序过程中，每个循环必须同时存在绿色和红色荧光信号才能确保测序成功。 因此，在选择指标时应考虑绿色信号和红色信号的平衡。
3.常见的指数类型有哪些？
常见的双重索引通常包括唯一双重索引（UDI）、唯一双重条形码（UDB）和组合双重索引（CDI），可显著减少索引跳跃和错误分配。
UDI&UDB：两端指标一一对应，分组设计，可两端交叉验证；
由 Illumina 提供的 Stubby UDI 引物套件
CDI：两端的索引可以按照一定的要求进行组合，形成双端索引库；
Illumina 的 384 CDI 引物，Set1-Set2 由
Illumina为了提高通量和扩增效率，降低测序成本，在Novaseq等高通量测序仪上引入了阵列流动池（PFCT）和独家扩增（ExAmp）聚类技术，但却无意中放大了样本标签错配现象和index hopping。
图3 Illumina不同仪器型号采用非图案化流动池或图案化流动池
为了弥补HiSeq3000/4000、HiSeq X Series、NovaSeq等测序平台凸显的index hooping问题，Illumina提出了将index放在文库两端的策略，可以进行双边验证，剔除不匹配的adapter。当使用两端唯一index时，index错误分配率将降低至0.01%。相比之前常规的index置换组组合方式，index hopping将减少两个数量级。
在PCR-free文库构建中，可以使用单端标签接头，标签错配主要由测序错误引起，整体上标签错配率较低（平均0.0004%，最高0.001%），但在靶向捕获文库构建中，由于多个步骤会导致标签错配，通常使用UDI/UDB/CDI接头，因此crosstalk问题被放大。
4.NGS适配器有哪些常见类型？
随着测序技术的发展，接头的种类越来越多，例如单/双接头（如第3节所述）、UMI接头、转座酶接头、完全/不完全接头等等，适用于多种应用场景。本部分系统地整理了这些接头，为您提供接头选择的基础。
4.1 UMI 适配器
唯一分子识别符（UMI）接头是低频突变检测和绝对定量的利器。UMI是已知序列的随机合成序列，可设计为完全随机的核苷酸链、部分简并的核苷酸链或固定的核苷酸链。长度通常为10nt（单端UMI）或5-8nt（双端UMI）。其作用是在扩增前冻结DNA片段的状态，每个DNA分子对应一个UMI。因此在生物信息学分析过程中，可以区分不同来源的DNA模板，区分哪些是PCR扩增和测序过程中随机误差造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的，从而滤除背景噪音，实现低频、极低频突变的精准检测，对不同的DNA分子进行绝对定量。在低频突变检测中有着广泛的应用，特别是在肿瘤研究领域。
图4 UMI适配器示意图 Illumina平台结构
4.2 完整适配器
完整接头是PCR-free文库的必备产品，它包含了测序所需的全部序列，如Illumina平台中的P5、P7、RdS1、RdS2等，还根据测序要求添加了index序列和UMI序列。有了完整接头，就无需通过PCR引入其他接头，就可以直接测序。因此，可以使用完整接头构建PCR-free文库。PCR-free文库可以降低PCR扩增的偏向性、错误率和序列重复，增加一些高GC或高AT区域的覆盖度，这些区域在群体基因组研究中被广泛使用。
由 Illumina 平台提供的完整适配器产品
由MGI平台提供的完整适配器产品
图5 完整适配器图
4.3 不完整的适配器
不完全接头需要在接头连接后通过PCR引入其他序列才能形成完全接头，其特点是连接效率高，有效文库率高；PCR过程是对完全文库起富集作用，保证有效文库的浓缩，也可以引入双端标签和UMI序列。
4.4 Tn5 适配器
Tn5接头利用Tn5的限制性内切酶活性，将部分接头序列连接到DNA片段的两端，使片段化和接头连接同时进行，节省时间和样品，最后通过PCR引入剩余的接头序列、index、UMI等序列，形成完整的文库，可用于构建Cut&tag文库。
图6 Tn5接头文库构建示意图
5. 如何为您的测序平台选择合适的NGS适配器？
目前，主流的测序平台有两大：Illumina和华大智造。
就 Illumina 平台而言，Illumina NGS 适配器由
Complete和UDI NGS适配器不用担心耦合问题，适合追求方便使用的客户；CDI NGS适配器管子少，体积小，适合追求方便存放和携带的客户。PCR-free需要使用Complete NGS适配器。
对于 Illumina
| 管道 | 希夫NGS® 德NA 图书馆准备 384 CDI 引物（适用于 Illumina），第 1 组（8*12，96 个索引） | 12412ES |
| 希夫NGS® 德NA 图书馆准备 384 CDI 引物（适用于 Illumina），第 2 组（8*12，96 个索引） | 12413ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 引物（适用于 Illumina），第 1 组（96 个索引） | 12414ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 引物（适用于 Illumina），第 1 组（96 个索引） | 12415ES | |
| 在盘子里 | Hieff NGS® Stubby UDI 引物试剂盒（适用于 Illumina）（1-384 索引）套装 1-4 | 12407ES |
| 适用于 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引物试剂盒 集合1（96 孔板，1-96 索引） 集合 1 | 12327ES | |
| 适用于 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引物试剂盒 集合2（96 孔板，97-192 索引） 第 2 组 | 12328ES | |
| 适用于 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引物试剂盒 集合3（96 孔板，193-288 索引） 第 3 组 | 12329ES | |
| 适用于 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引物试剂盒 套装4（96 孔板，289-384 索引） 第四组 | 12330ES |
对于MGI
| 希夫 新一代测序™ 适用于 MGI、Set1/Set2 的双 UMI UDB 适配器套件 | 96 指数种类 | |
| 希夫NGS™ MGI 完整适配器套件， Set1/Set2/Set3(询问) | 13360ES | 8 指数种类，41-48 |
| 13361ES | 16 指数种类，57-72 | |
| 13362ES | 96 索引种类，1-96 |
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