NGS中各类磁珠：DNA\RNA\mRNA磁珠
磁珠是高通量测序文库构建中必备的产品之一，可以纯化DNA或RNA、筛选目标大小的DNA片段、富集目标核酸等。随着测序技术的发展，出现了专门针对不同应用领域的磁珠，包括DNA纯化磁珠、DNA大小选择磁珠、RNA纯化磁珠、mRNA富集磁珠等。 那么各种磁珠的原理都有哪些呢？该如何选择呢？
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1. DNA 珠
2. 星形DNA珠介绍
3. RNA 纯化珠
4. 富集mRNA的磁珠
5.
1. DNA 珠子
1.1 基本原理
磁珠纯化核酸的原理是基于固相可逆固定化（SPRI）。在一定条件下，核酸选择性地结合到磁珠上，而污染物则留在溶液中。施加磁场后，与目标分子结合的磁珠从溶液中分离出来，然后清洗磁珠以进一步去除污染物。由于磁珠与核酸分子的结合是可逆的，因此可以用低盐缓冲液将核酸从磁珠上洗脱下来。
磁珠外表面修饰有硅羟基或者羧基功能团，在含有PEG和高盐离子的纯化缓冲体系中，DNA通过DNA盐离子羧基形成离子桥与磁珠结合，这种结合是可逆的，在不含PEG和盐离子的TE缓冲液中离子桥被拆除，最终纯化DNA。基于羧基磁珠，不同的磁珠投入量和纯化缓冲液会结合不同的片段大小。磁珠优先结合大片段的DNA，因此第一轮用磁珠结合大于目标片段的片段，上清保留；第二轮，磁珠结合上清中的目标片段后弃去上清；最后将目标片段从磁珠上洗脱下来，即为目标大小的DNA片段。
图 1. 羧基磁珠结构
图2. DNA纯化磁珠原理
1.2 操作流程
图 3. DNA 纯化步骤
图 4. DNA 大小选择步骤
1.3 磁珠使用技巧
提高产量并准确选择尺寸
（1） 使用前充分混合，并平衡 将磁珠放置于室温下至少30分钟。
——PEG在磁珠中的溶解度 缓冲液容易受到pH值和温度的影响。使用前，必须平衡 至室温 磁珠悬浮均匀，PEG充分溶解，避免影响吸附分离效果
（2） 吸附时间要充足，充分混合 使吸附充分；
（3） 纯化或分离过程中用80％乙醇洗涤；
——80%乙醇下，核酸脱水聚集紧密，不会溶解。体系中残留的酶、缓冲液、杂质等用乙醇清洗干净，可得到更纯净的 图书馆。
（4） 在尺寸选择时，确认样本量，保证磁珠添加比例正确；
——尺寸选择时需要准确输入相应体积的磁珠，确保比例准确，因为缓冲液中PEG和盐离子浓度的变化可能会影响结果。
（5） 在洗脱步骤之前，让酒精完全挥发，但 防止珠子 过度干燥
——一般2~3min即可干燥，当磁珠数量较多，干燥困难时， 建议在多个离心管中操作。
（6） 如果磁珠结块或结块，洗脱时间 可以扩展 充分搅拌后；
——可能是因为 DNA 中的杂质或 干燥时间过长。一般情况下，当DNA中杂质较多时，建议先进行纯化 前 尺寸选择。
2. 星形DNA珠介绍
Hieff NGS™ DNA选择磁珠基于SPRI（固相反向固定化）原理，采用进口磁珠原料，配合优化的缓冲体系，可用于NGS文库构建过程中的DNA片段大小选择与纯化，使用方法与所用AMPure XP磁珠相同，片段回收效率、文库大小分布与其高度一致。
2.1 净化性能介绍
- 独特的缓冲系统：DNA片段低至 可恢复50bp。
- 回收率高：≥90%。
- 有效去除杂质：有效去除引物二聚体、dNTP、无机盐、蛋白质等杂质。
- 适用范围广：适用于酶切、连接、克隆、NGS建库等场景的DNA纯化。
表 1. 不同配比磁珠的DNA纯化回收效率
| 体验组 | 本批次磁珠回收浓度(ng/μL) | 回收率 | AMPure XP 珠组(ng/μl) ④ | 回收率 | 简历％ | |||
| 比率 | ① | ② | ③ | 平均的 | ||||
| 1.8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96.92％ | 22.2 | 94.37％ | 2.55％ |
| 0.8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82.19％ | 17.8 | 75.67％ | 6.52% |
| 0.6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42％ | 16.2 | 68.87% | 2.55％ |
图 5. 磁珠纯化效果琼脂糖凝胶电泳结果
M：1kb DNA梯状物；
2.2 尺寸选择性能
- 简单的 到 操作：分离原理及实验操作与XP磁珠完全一致
- 精准大小选择：分选出的片段大小准确、稳定
- 适用性广：适用于 建筑 DNA 和 RNA 文库及适应 各种样本类型的片段大小选择
- 超高性价比：质量稳定，价格更经济，售前售后服务更周到
图 6. DNA 大小选择结果
3. RNA 纯化珠
Hieff NGS™ RNA清洗剂基于SPRI原理，可高效去除蛋白质、盐离子等杂质，获得高纯度浓缩RNA样本，并精心优化酸性缓冲体系，保持RNA结构稳定，防止RNA降解。适用于RNA文库构建、去除rRNA后总RNA样本的纯化、体外转录RNA产物的纯化、RNA标记产物的纯化、合成RNA的纯化等。
- 高质量： 采用进口原材料，品质高度稳定
- 优化的缓冲体系：保证RNA的纯度和完整性，有效防止RNA降解
- 高效率： 高效回收，适用于RNA文库构建或体外 转录产物回收等
图7. 不同样品纯化后电泳图
4. 富集mRNA的磁珠
4.1 mRNA分离原理
mRNA分离富集磁珠是表面经过oligo（dT）修饰的磁珠，通过杂交原理，能特异性地与Poly A尾巴的mRNA结合，从总RNA或组织细胞中特异性地分离mRNA。本试剂盒通过优化产品配方，能高效地从动物、植物、昆虫、真核微生物的细胞和组织RNA中分离出高纯度的完整mRNA。
图 8.mRNA磁珠富集纯化原理
4.2 mRNA分离珠性能
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit 由
- 高效：45分钟内即可完成mRNA纯化
- 高纯度： 寡核苷酸（dT）磁珠特异性结合mRNA
- 可靠的： 获得的 mRNA 适用于体外 NGS 翻译、RT-PCR 和 cDNA 合成
图 9. mRNA 分离试剂盒纯化不同 RNA 样本中的 mRNA
注：管家基因产量代表mRNA回收的效果。rRNA相关基因产量 表征 rRNA 去除效率
4.3 mRNA磁珠常见问题解答
（1） 磁珠为什么会结块以及怎样解决？
——磁珠 团聚会降低mRNA的产量和纯度。样品中可能含有许多杂质，例如多糖、蛋白质和长链DNA。这些杂质会导致磁珠 团聚。解决方法是通过移液器吹动磁珠。 纯化之前可以通过 DNase 处理去除基因组 DNA。 如果初始样品量过大，超过磁珠的载量，磁珠也会出现团聚的情况，建议按照手册上的输入量进行操作。
（2） 为什么mRNA产量低？
——造成mRNA产量低的原因有很多：
- 由于细胞或组织的mRNA表达水平较低，可选择合适表达期的样本或适当增加样本总RNA输入量。
- 磁珠与样品的比例过低，影响mRNA与磁珠的结合。尝试增加 增加磁珠数量或减少样品输入量和体积。
- 杂交时间太短，可将孵育时间增加至10-15min；
- 洗脱不充分，需适当增加洗脱缓冲液的体积，增加洗脱时间和温度，或重复洗脱步骤两次。
（3） 如何有效消除rRNA？
——如果操作不当，纯化过程中rRNA会随mRNA非特异性结合到磁珠上， 尤其是当总RNA输入量很大时。 纯化过程中通常采用两轮结合 有效避免rRNA污染。 确保在洗涤实验过程中充分混合，以去除非特异性结合，并尽量去除rRNA污染。
（4） 对于许多下游应用来说，是否需要洗脱mRNA，磁珠是否会干扰下游的酶反应？
——一些下游反应可直接用磁珠进行而不需洗脱mRNA，比如RNA文库构建中的mRNA片段化和逆转录。但如果进行PCR反应，需要保证没有基因组DNA污染，否则会产生很多基因组扩增片段，干扰实验结果。具体操作可按照相应下游反应的说明进行，如RNA-Seq文库构建
（5） 该试剂盒能直接从细胞或组织中分离 mRNA 吗？
——不推荐！ 裂解液中含有一些会影响mRNA结合的成分，建议使用专门的试剂盒。
5. Yeasen 磁珠产品推荐
Hieff NGS™系列磁珠作为
表 2.
| 产品名称 | 猫＃ | 规格 | 使用和应用场景 |
| 希夫NGS™ DNA 选择珠 | 12601ES03 | 1 毫升 | 👉新一代测序DNA 纯化和尺寸选择 👉PCR 产物纯化 👉酶切和连接产物的纯化 |
| 12601ES08 | 5 毫升 | ||
| 12601ES56 | 60 毫升 | ||
| 12601ES75 | 450 毫升 | ||
| 希夫NGS™ RNA 清洁剂 | 12602ES03 | 1 毫升 | 👉RNA纯化 👉去除 rRNA 后总 RNA 样本的纯化 👉RNA标记产品的纯化 |
| 12602ES08 | 5 毫升 | ||
| 12602ES56 | 60 毫升 | ||
| 12602ES75 | 450 毫升 | ||
| Hieff NGS™ mRNA 分离主试剂盒 | 12603ES24 | 24 T | 👉mRNA分离和纯化 👉体外转录 mRNA 纯化 |
| 12603ES96 | 96吨 |
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