NGS图书馆建设中涉及的关键酶

高通量测序通常被称为新一代测序 (NGS) 技术，与最初的 DNA 测序方法（例如桑格测序）相比，它代表了一次重大飞跃。NGS 可以同时分析数十万甚至数百万个核酸分子序列。它的优点包括卓越的通量、成本效益、可扩展性和广泛的应用范围，使其成为全球主要的测序技术。

NGS 测序工作流程包括四个主要阶段：样本制备、文库构建、测序和数据分析。文库构建的核心是将标准化的 NGS 平台接头序列连接到片段化基因组 DNA 的两端。此步骤旨在生成充足的文库核酸分子，通过 PCR 扩增为 NGS 仪器上的测序做好准备。根据样本的性质，NGS 文库构建可分为 DNA 文库构建和 RNA 文库构建。酶在这些相互关联的实验中起着关键作用。那么，哪些关键酶参与了文库构建过程？

Next-generation sequencing workflow

图 1. 新一代测序工作流程^[2]

1. DNA文库构建及其关键酶
2. RNA文库构建及其关键酶
3. DNA & RNA 文库构建中NGS核心酶的使用指南

1. DNA文库构建及其关键酶

在DNA文库构建过程中，TA克隆连接接头文库构建是目前最常用的技术手段，其主要建库流程如下：

DNA library construction process (Illumina)

图2. DNA文库构建过程（Illumina）

1.1 DNA 碎片

目前测序仪的测序长度一般在150-500个碱基对（bp）范围内。因此，必须采用机械或酶促碎裂方法将较大的基因组DNA片段分解成较小的片段。机械碎裂会导致相对较高的样品损失，并且涉及更复杂的操作过程。另一方面，酶促消化是碎裂基因组DNA的常用方法。与机械方法相比，酶促消化更具成本效益且更简单，反应只需在加入碎裂酶后一段时间即可完成。

目前主要使用两种类型的片段。一种依赖于基于转座子原理的 Tn5 转座酶，另一种利用内切酶混合物。然而，这些片段的有效性可能受到 DNA 的 GC 含量和碱基偏好的影响。相比之下，由 Yeasen (Cat#12917) 具有稳定的消化效果，与 Tn5 转座酶相比，其位点偏好明显较低。它们对各种类型的 DNA 样本（包括来自 FFPE 样本的样本）始终产生出色的测序结果。

1.2 末端修复，dA-Tailing

片段化的DNA会产生5'/3'粘性末端及平端DNA，所有粘性末端均需要转化为平端，包括去除3'突出端和填补5'突出端的DNA末端。使用TA连接进行接头连接时，DNA片段也需要在5'端进行磷酸化，并在3'端添加“A”以与带有“T”粘性末端的接头互补。上述过程是在T4 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和塔克 DNA 聚合酶。
T4 DNA 聚合酶（目录号：12901）具有5'→3'DNA聚合酶活性，可催化DNA沿5'→3'方向合成，并填充5'突出端；同时该酶还具有3'→5'外切酶活性，可裂解3'突出端，从而将含有粘性末端的DNA片段转化为平端DNA。
由于合成的PCR引物和接头的5’端通常是羟基而不是磷酸基，因此需要T4多核苷酸激酶（Cat#12902）在ATP存在下催化ATPγ-磷酸基转移到寡核苷酸链的5’-羟基端，为下一步接头连接做准备。
硫脲 DNA聚合酶 (Cat#13486)具有5'→3'聚合酶活性，可以从5'→3'方向合成DNA，同时具有脱氧核苷酸转移酶活性，可以在PCR产物的3'端添加一个核苷酸“A”。

Multiple enzymes involved in the end repair process

图3. 多种酶参与末端修复过程

图4. 毛细管电泳检测发现，S-taq能非常高效地在基因片段3’端ATCG的四个碱基上添加A。

1.3 接头连接

Adapter是文库的重要组成部分，在Illumina测序领域，常用的Y型Adapter有P5/P7、Index、Rd1/Rd2 SP序列。其中P5/P7序列的作用是与测序芯片上的序列配对，从而将待分析的片段锚定到Flow Cell上进行桥式扩增；Index序列用于区分混合文库中待测序的不同样本；Rd1/Rd2 SP表示Read1和Read2测序引物的结合区域。

对于接头连接任务， T4 DNA 连接酶（目录号#12996）是标准选择。它具有修复双链 DNA 中发现的单链缺口并重新连接相邻核苷酸的能力。

General adapter ligation process(Illumina)

图5. 通用接头连接流程（Illumina）

图 6. 通过将 170-bp DNA 与 80-bp 接头连接来验证 T4 DNA 连接酶突变体。

1.4 PCR扩增

通过PCR反应获得足够数量的带有接头的DNA序列，在机上完成样本核酸序列的测序。Hieff Canace^商标 PCR常用的Pro High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#13476）具有5'→3'聚合酶活性，可按5'→3'方向合成DNA；同时还具有3'→5'外切酶活性，可纠正扩增过程中碱基的错误掺入，从而快速、高保真地扩增DNA片段。

2. RNA文库构建及其关键酶

根据RNA的种类，RNA文库的构建可分为mRNA文库、LncRNA文库等。常规的RNA文库构建包括以下几个过程：

mRNA library construction process(Illumina)

图7. mRNA文库构建流程（Illumina）

2.1 RNA富集

无论是真核生物还是原核生物，核糖体 RNA (rRNA) 都是最丰富的 RNA，占总 RNA 含量的 80%。直接对样本的总 RNA 进行测序时，很大一部分测序数据将与 rRNA 相关。为了减轻这种干扰，必须采用 RNA 富集方法。主要有两种方法：基于寡聚 dT 的 mRNA 富集和 rRNA 消耗方法。

在真核生物中，mRNA 在 3' 端表现出明显的 poly(A) 结构。Oligo-dT 珠可用于捕获从样本中转录的所有 mRNA，使其适合于转录分析，尤其是对于高质量的 RNA 样本。另一方面，rRNA 消耗方法对样本质量的要求更宽松，既可以应用于低质量样本（例如 FFPE 样本），也可以应用于高质量的 RNA 样本，以及原核生物样本。常用的商业方法是使用 RNase H 消化去除 rRNA，具体步骤如下：

合成旨在与 rRNA 结合的特定寡核苷酸探针。
使用能够降解 RNA-DNA 混合链中的 RNA 的 RNase H（Cat#12906）来选择性地去除与探针结合的 rRNA。
最后，用 DNase I（目录号 10325），它可以降解单链和双链 DNA，有效消除 rRNA。有关 DNase I 的更多信息，您可以关注此链接。

Schematic diagram of enzyme-based rRNA depletion

图8：基于酶的rRNA消耗示意图^[5]

2.2 RNA碎片

通常在二价金属阳离子和高温的作用下，RNA的大片段会断裂成小片段。

2.3 第一链 cDNA 合成

将所得靶RNA逆转录成cDNA的第一链。由于RNA很容易被环境中的RNases降解，因此使用 RNase 抑制剂（Cat#14672）在逆转录过程中，可以抑制这些酶的活性，保护 RNA 免受 RNase 降解。同时，逆转录酶（目录号#11112）用于将模板RNA逆转录成cDNA。逆转录酶具有RNA依赖性的DNA聚合酶活性，可以以RNA为模板，以5'→3'方向合成cDNA。DNA单链与RNA模板互补。

在第一链 cDNA 合成中，放线菌素 D 的加入无疑改善了链特异性文库的构建，显著提高了链特异性。这一创新简化了实验过程，为研究人员简化了实验过程。

然而，放线菌素 D 也有缺点：它具有毒性，需要避光。在当今对预混和板库构建试剂盒的需求不断增长的背景下，避光的必要性限制了板库试剂盒的进步。

幸运的是， Yeasen ZymeEditor 平台引入了突破性的 MMLV 酶突变体 (Inquiry)，可取代放线菌素 D 的功能。套件（目录号：12340ES）采用无味、无毒且no 需要避免光。它提供了优越的链特异性，消除了与健康和光敏感性相关的担忧。

图 9：对 MMLV 进行工程改造，以识别可能有助于标准 RNA 测序的 MMLV 突变体

2.4 第二链 cDNA 合成

通过逆转录产生的单链 cDNA 非常不稳定，需要在 DNA 聚合酶 I 的影响下立即合成 cDNA 的第二链。在第二链合成过程中，RNase H 发挥作用，从 RNA-DNA 杂交结构中去除 RNA 链。它与 DNA聚合酶I（目录号12903）以促进互补的第二条 cDNA 链的催化合成。DNA 聚合酶 I 具有 5'→3' DNA 聚合酶活性，在模板和引物的引导下，合成一条以 5'→3' 方向与单链 cDNA 互补的序列。

后续步骤包括末端修复、dA-Tailing、接头连接、PCR扩增等，这些步骤在DNA文库构建步骤中有详细说明，在此不再赘述。值得注意的是，逆转录完成后，无需对核酸片段进行进一步的片段化。

3. DNA & RNA 文库构建中NGS核心酶的使用指南

Yeasen 是一家从事分子、蛋白质、细胞三大生物试剂研发、生产和销售的生物技术公司。 Yeasen 生物技术公司生产多种与NGS建库相关的酶，您可以从下表中选择最合适的建库产品。

表 1.DNA 和 RNA 文库构建中 NGS 核心酶指南

类型	产品定位	产品名称	猫＃
RNA文库建造	核糖体RNA 消耗/第二链 cDNA 合成	核糖核酸酶H	12906ES
	核糖体RNA 消耗	重组 DNase I	10325ES
	第一链 cDNA 合成	小鼠 RNase 抑制剂	14672ES
	第一链 cDNA 合成	海法^商标 IV 逆转录酶 (询价)	11112ES
	第二链 cDNA 合成	DNA聚合酶I	12903ES
RNA文库建造 & DNA 图书馆建造	结束修复	T4 DNA聚合酶	12901ES
	结束修复	T4多核苷酸激酶	12902ES
	dA 尾矿	硫脲 DNA聚合酶	13486ES
	接头连接	快的 T4 DNA连接酶	10301ES
	聚合酶链反应放大	2×Super Canace® II 高保真混合物，用于文库扩增	12621ES

表2.DNA 和 RNA 文库准备工具包

	姓名	猫＃	笔记
脱氧核糖核酸	Hieff NGS DNA 文库制备试剂盒	13577ES	肿瘤/机械方法
	Hieff NGS OnePot Pro DNA 文库制备试剂盒 V2	12194ES	肿瘤/酶法
	Hieff NGS OnePot Illumina II DNA 文库制备试剂盒	13490ES	病原体/酶/常规时间（140分钟）
	Hieff NGS OnePot Flash DNA 文库制备试剂盒	12316ES	病原体/ 酶/ 超快 (100分钟)
	Hieff NGS DNA&RNA 文库共制备试剂盒 V2	12305ES	病原体/酶/DNA 和 RNA 共制备
核糖核酸	Hieff NGS Ultima 双模式 mRNA 文库制备试剂盒	12308ES	不含寡核苷酸 dT 磁珠，11 管
	Hieff NGS Ultima 双模式 mRNA 文库制备试剂盒	12309ES	oligo dT 磁珠 plus，14 管
	Hieff NGS® Ultima 双模式 RNA 文库制备试剂盒	12310ES	预混版，5 管
	Hieff NGS ® EvoMax RNA Library Prep Kit（预混版）（放线菌素D 自由的）	12340ES	预混版本，（放线菌素 D 自由的）
	Hieff NGS® MaxUp rRNA 耗竭试剂盒（植物）	12254ES	植物
	Hieff NGS® MaxUp 人类 rRNA 耗竭试剂盒（rRNA 和 ITS/ETS）	12257ES	人类

参考：

[1] Mardis, Elaine R. 新一代测序平台[J]. 分析化学年鉴, 2013, 6(1):287-303。
[2] Gulilat M, Lamb T, Teft WA 等。靶向下一代测序作为切除医学的工具[J]。BMC Medical Genomics，2019，12(1):81。
[3] Lundberg KS, Dan DS, Adams M 等. 利用从Pyrococcus furiosus分离的耐热DNA聚合酶进行高保真扩增[J]. 基因, 1991, 108(1):1-6。
[4] Miyazaki K. 用内切酶V进行随机DNA片段化：在DNA改组中的应用[J]. 核酸研究，2002，30(24):e139。
[5] Baldwin A, Morris AR, Mukherjee N. 一种用于 RNA 测序的简单、经济有效且可扩展的消耗人类核糖体 RNA 的方法 [J]。Current Protocols, 2021, 1(6):e176。

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