1 遺傳黴素的作用原理

基因黴素 (Geneticin, G418) 是一種氨基糖苷類抗生素，透過與原核和真核細胞中的 70S 和 80S 核醣體結合來阻斷肽鏈延伸，從而抑制蛋白質合成。這種機制對細菌、酵母菌、植物和哺乳動物細胞等具有毒性。當細胞成功轉染並整合了新黴素抗性基因（如neo基因）後，該基因編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶（APH(3)Ⅱ）能夠共價修飾G418，使其失活，從而賦予在含有G418的選擇性培養基中生長的細胞抗性。

在分子遺傳學檢測中，G418是常用的穩定轉染試劑之一。

2 基因黴素的應用

2.1 穩定轉染細胞株的篩選

• G418透過抑制蛋白質合成來篩選含有抗性基因（例如neo基因）的細胞。抗性基因編碼的氨基糖苷類磷酸轉移酶使G418失活，使細胞對G418產生抗性。通常，哺乳動物細胞篩選範圍為200 – 2000 μg/mL，最常用的工作濃度為100 – 700 μ g/mL。其中植物細胞為10-100 μg/mL，酵母菌細胞為500-1000 μ g/mL，以下以G418為參考，針對部分細胞類型所採用的濃度。

細胞	應用	基因黴素活化濃度(μg/mL)	參考文獻
毛黴屬	a) 在生長培養基中培養 b) 在冷凍乾燥細菌上培養	a) 10 μg/毫升 b) 30 微克/毫升	Hirth 等。等， 程式國家學院科學， 第 79 卷，7356-7360 頁 (1982 年)。
哺乳類	a) 用於篩檢 b) 為了維持成長	a)400 -1000 μg/mL b) 200 μg/毫升	迦南和伯格， 程式國家學院科學， 第79卷，5166-5170（1982年）。
植物	a) 用於篩檢 b) 為了維持成長	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/毫升	Ursic 等。等， 生物化學。生物物理學。決議通訊社， v.101:3,1031-1037（1981）。
酵母菌	a) 用於篩檢 b) 為了維持成長	a) 500 μg/毫升 b) 125-200 μg/mL	希門尼斯和戴維斯， 自然， 第287卷，869-871（1980年）。
細菌	用於篩檢	16微克/毫升	Waitz 等人。等， 抗微生物。化療藥物代理， 第 6:5, 579-581 (1974)。

2.2 基因敲除與基因轉移

• 在基因敲除中，可以利用G418篩選成功敲除目的基因的細胞。在基因轉移中，G418 促進外來基因整合到宿主細胞基因組中。

2.3 細胞培養中的抗性選擇

• 在細胞培養過程中，G418 用於篩選對抗生素有抗藥性的細胞，這些細胞通常攜帶特定的抗藥性基因。

3 基因黴素相關實驗步驟

3.1 製備G418儲備溶液（50mg / mL，有效濃度）

1）活動單位的換算

使用公式轉換：(1000/A0) × A1 = A2，其中 A0 是 G418 的效力，因批次而異。請參閱相應批次的品質控制報告或瓶子上的標籤。 A1 是需要製備的 G418 的活性濃度。 A2 是需要稱量的實際粉末體積濃度。

例如，如果該批次的G418效力為750 U / mg，並且您想要製備50 mg / mL的有效濃度，則實際要製備的粉末濃度為1000/750×50 mg / mL = 66.67 mg / mL。

若配製10 mL G418原液（有效濃度50 mg/mL），則需要666.7 mg粉末。

• 滅菌與儲存

根據以上換算所得的實際粉末重量，加入10 mL無菌去離子水中，完全溶解。

首先，用 5 mL 無菌去離子水預濕 0.22 μm 注射器過濾器，去除所有水。然後使用此過濾器過濾除菌，並分裝成一次性使用的小體積（例如 1 毫升），並在 -20°C 下保存 1 年。

3.2 殺滅曲線的建立

1) 第一天：將未轉化細胞以 20-25% 的細胞密度接種於適當的培養板中，並在 37°C、CO 條件下培養過夜₂。

2）根據細胞類型在適當範圍內設定濃度梯度，至少選擇6個濃度（G418對分裂期細胞活性最強，因此應先將細胞培養一段時間後再加入G418），例如哺乳動物細胞，設定0、50、100、200、400、800、1000 μg/mL。

3)第二天：棄去舊培養基，換成新鮮配製的相應藥物濃度的培養基，每個濃度重複培養三次。

4）每3-4天更換一次新鮮含藥培養基。

5)以固定的時間間隔（例如每2天）進行活細胞計數，以確定阻止未轉染細胞生長的適當濃度。選擇在理想天數內（一般7-10天）能殺死大多數細胞的最低濃度作為穩定轉染細胞系篩選的工作濃度。

3.3 穩定轉染細胞的篩選

• 益生生物提供的G418遺傳黴素（60220ES）效力≥720 U/mg、純度~98%、批次穩定，價格接近其他公司G418產品的三分之一。
• 每3-4天更換一次含有藥物的篩選培養基。
• 選擇7天後觀察並評估細胞克隆（菌落）的形成。菌落可能需要一周或更長時間才能形成，這取決於宿主細胞類型、轉染和篩選效果。
• 挑取5~10個抗性克隆,轉移至35mm細胞培養板中,用含藥篩選培養基維持7天。
• 換成正常培養基培養後。

4 產品推薦

G418 遺傳黴素 (60220ES) 提供 Yeasen Biotech 的功效為≥720 U/mg、純度~98%、批次穩定，價格接近其他公司 G418 產品的三分之一。

規格	S*	T*	Yeasen	Yeasen 優勢
含量（高效液相層析法）	/	/	~98％	高純度
效力 (單位/毫克)	≥720微克/毫克	707-721 微克/毫克	≥720微克/毫克	高效率
價格(美元/5克)	~1000	~1000	~200	廉價

5 實驗案例

在大腸桿菌中，G69和G99是兩個不同批次；基因黴素濃度分別為8mg/L、12mg/L、16mg/L，有效最低濃度為16mg/L，可完全抑制雜菌的生長。