1. 什麼是樹突狀細胞（DC）？
樹突狀細胞（DC）是人體中最有效的抗原呈現細胞（APC）。 DC 是唯一能夠強烈刺激幼稚 T 細胞增生的 APC。其他類型的APC（例如單核細胞、巨噬細胞、B細胞等）只能刺激活化或記憶T細胞。因此，DC細胞是適應性T細胞免疫反應的啟動者，在腫瘤免疫中扮演極為重要的角色。 DC細胞表面高度表現MHC-I和MHC-II分子，並具有特定的表面標記。它們攝取、加工並刺激T細胞活化抗原，最終決定T細胞的分化方向。
2. 直流電源
DC 細胞在體內的存在量非常少。從體內直接從體內分離DC需要較長的時間且細胞產量很低，大大限制了DC的研究和應用。但DC可以由不同組織中的DC前驅細胞分化誘導，如骨髓液中的前驅細胞、週邊血和臍帶血中的單核細胞。
對於人類來說，由於人類週邊血液獲取最方便，且單核細胞數量最多，因此最常用的方法是從人類週邊血液單一核細胞（PBMC）誘導DC。對於小鼠來說，最常見的方法是從骨髓細胞誘導DC，也就是骨髓來源的樹突細胞（BMDC）。
圖1. 經典BMDC製備方法示意圖
3. BMDC製備方法
製備小鼠BMDC的常用方法有：
3.1 經典BMDC培養方法-Inaba方法（改良）
3.2 BMDC的大規模製備－Sons法
3.3 BMDC的大規模製備－Lutz法
3.1 【經典BMDC培養方法】-Inaba法（改良）
【背景】
一個。 透過 Inaba 方法獲得的 BMDC 數量為 5-7 x 106/老鼠;
b. 原始的Inaba方法僅使用GM-CSF來誘導BMDC的產生。所獲得的BMDC雖然在混合淋巴細胞反應中刺激能力較強，但DC的成熟度不如GM-CSF+IL-4聯合誘導的DC。因此後續改良的方法常採用GM-CSF+IL-4聯合誘導。
【栽培步驟】
3.1.1 取得小鼠骨髓細胞
1） 以頸椎脫臼法殺死小鼠(6-10週齡)，手術切除所有股骨和脛骨，用剪刀和鑷子盡可能去除骨骼周圍的肌肉組織。
[筆記】不要損傷骨頭。
2） 將骨頭移至超淨台上，放入含有70%酒精的無菌培養皿中浸泡2-5分鐘，消毒滅菌，再用無菌PBS清洗兩次。
3） 將骨頭移至另一個含有 PBS 的新培養皿中，用剪刀剪斷骨頭的兩端，然後用注射器萃取 PBS。將針頭從骨頭的兩端插入骨髓腔，反覆將骨髓沖入培養皿中，直到骨頭完全變白。
4） 收集骨髓懸浮液，用200目尼龍網濾除小碎片和肌肉組織。
5） 將濾液在 1200 度下離心 轉速 5 分鐘 棄上清液。
6） 加入2 ml氯化銨紅血球裂解緩衝液（1x），重懸細胞，室溫孵育3-5 分鐘，最多 10 分分鐘
7） 加入 10 ml PBS 以中和裂解緩衝液的作用，然後以 1200 rpm 的速度離心 5 分鐘 棄上清液。
8） 用 PBS 清洗一次，然後用含有 10％ FBS 的 RPMI1640 培養基重懸細胞。已獲得小鼠骨髓細胞。
氯化銨紅血球裂解液的製備：
一個。 製備 10x 儲存溶液如下：秤重 82.9 氨氮4氯氣，10.0g KHCO3 和0.37g鈉2EDTA，溶於1L蒸餾水，過濾，用0.22 μm濾膜除菌，4℃保存6個月；
b. 使用前，用無菌蒸餾水將10x儲存溶液以1：9的比例稀釋為1x工作溶液。
[筆記] 由於氯化銨紅血球裂解液對骨髓細胞有一定的損害作用，因此應盡可能縮短溶血時間。
3.1.2 誘導 BMDC 分化
1） 計數步驟1中所得的小鼠骨髓細胞，調整細胞濃度為0.5-1×106/ml含10％FBS的RPMI 1640完全培養基。
2） 將細胞接種於24孔培養板中，每孔1ml細胞，加入重組鼠GM-CSF（20 納克/毫升) 和 IL-4 (10 納克/毫升), 培養於37℃、5% CO2 孵化器。這是文化的第0天。
【筆記】
一個。 一般約4-5x107 可以從一隻小鼠身上收穫骨髓細胞，因此可以接種24孔板的至少40-50個孔。
b. GM-CSF 和 IL-4 的濃度範圍為 20-50 納克/毫升 和 10-40 納克/毫升， 分別。
3） 每2天輕輕搖晃培養板一次，然後用新鮮培養基替換3/4體積並補充細胞激素。
4） 在第5天和第8天之間，輕輕吹動培養基以收集懸浮細胞和鬆散附著的細胞。
5） 1200 度離心 轉速 5 分鐘 棄上清液。
6） 將細胞重懸於含10%FBS的RPMI 1640完全培養基中，計數，調整細胞濃度為1×106/ml，並加入重組小鼠GM-CSF（20 納克/毫升) 和 IL-4 (10 納克/毫升）。
7） 將細胞接種於 100 毫米培養皿（每皿最多 10 毫升）或 6 孔培養板（每孔 2 毫升）。
8） 繼續在37℃、5% CO2 中培養2 孵化器內培養 1-2 天。
9） 收集懸浮細胞，這些細胞是更成熟的 BMDC。
【筆記】
一個。 步驟2.5-2.8為重新鍍層步驟，目的是為了讓步驟2.4所獲得的BMDC更加成熟。
b. 重新鋪板後3小時內可以看到許多帶刺的貼壁細胞從DC簇中遷移出來，而培養1天后會發現這些貼壁細胞脫離培養板底部，可以看到很多典型的DC漂浮在培養基中。
3.1.3 BMDC 完全成熟
[注意] 步驟2中獲得的BMDC不是完全成熟的DC。若想獲得完全成熟的DC，仍需要透過LPS、CD40L或TNF-a進行誘導。
1） 將步驟 2.4 或 2.9 中獲得的 BMDC 以 1200 的速度離心 轉速 5 分鐘 棄上清液。
2） 以含有重組小鼠 GM-CSF 的 RPMI 完全培養基重懸沉澱物（20 納克/毫升) 和 IL-4 (10 納克/毫升), 並調整細胞濃度為1×106計數後為/ml。
3） 加入24孔培養板，並加入成熟誘導劑，如TNF-α（250 單位/毫升）、脂多醣（1 μg/mL) 或 CD40L (1 （微克/毫升）。
4） 培養於37℃、5% CO2 孵化器內培養 2 天。
5） 收集懸浮的細胞和鬆散地附著在壁上生長的細胞，這些細胞即為成熟的樹突狀細胞。
3.2【BMDC量產法】-Son 方法
【背景】
一個。 此方法可得到30-40×106 DC/mouse 在7天內，是Inaba經典方法的7-10倍。 DC經14.5％甲泛醯胺梯度離心後純度(即CD11c+/I-Ab+細胞)可達85-95％。
b. 此方法所得的DC的內吞能力比Inaba經典方法弱，但分泌的IL-12p70的量相似。
c. 此方法所獲得的DC在混合淋巴細胞反應中刺激能力比Inaba經典方法更強。
d. 透過此方法獲得的DC可以誘導更強的特異性T細胞反應。
e. 綜上所述，Son方法比經典方法可以獲得更多、更成熟的BMDC。
【栽培步驟】
3.2.1 取得小鼠骨髓細胞
請參閱 Inaba 方法（已修改）中的對應步驟。
3.2.2 大量BMDC的製備
1） 計數步驟1中所得的小鼠骨髓細胞，調整細胞濃度為2×105/ml含10%FBS的RPMI 1640完全培養基。
2） 接種於6孔培養板中，每孔5ml細胞，加入重組鼠GM-CSF（1000 單位/毫升)和IL-4(1000 單位/毫升), 培養於37℃、5% CO2 孵化器。
3） 培養第4天，向培養系統補充重組鼠GM-CSF（1000 單位/毫升)和IL-4(1000 單位/毫升）。
4） 收集培養第 7 天的 DC，用 2-4 ml RPMI 1640完全培養基，加入等體積的14.5%（w/v）美帕內瑪，室溫離心20 最低 1200xg。
5） 收集中間層，用RPMI 1640完全培養基洗滌三次，備用。
[筆記] 此時的 DC 是未成熟的 BMDC。如果您想進一步使其成熟，請跳至步驟 3。
3.2.3 BMDC 全面成熟
1） 將步驟 2.4 收集的 BMDC 重新接種，並加入重組小鼠 GM-CSF (1000 單位/毫升)和IL-4(1000 單位/毫升)，以及LPS (1-10 微克/毫升）到文化系統
2） 培養於37℃、5% CO2 培養箱中培養2天即可獲得成熟的BMDC。
3.3【BMDC批量製備方法】-Lutz方法
【背景】
一個。 Lutz法與Son法類似，兩種方法都可以大量製備BMDC，但Lutz法比Son法應用更廣泛。
b. 此方法可獲得更多BMDC，高達1-3 x 108 DC/mouse，純度可達90-95%；
c. 此方法使用的細胞激素濃度比Son方法低很多，僅200 單位/毫升，然後下降到30-100 單位/毫升 培養第8~10天，可大幅節省試劑成本；
d. 此方法與Inaba經典方法及Son方法最大的不同在於，將骨髓細胞培養在細菌培養皿（Petri dish）中，而不是細胞培養板中。稻葉解釋道，細菌培養皿不容易讓骨髓中的巨噬細胞貼壁，進而抑制巨噬細胞的發育，避免巨噬細胞對DC成熟的抑製作用。這可能是該方法能夠以較低的接種密度獲得大量 BMDC 的主要原因。
e. 但此方法培養時間較長，需10-12天。一方面，這是為了獲得更多的BMDC。另一方面，大多數粒細胞和淋巴細胞很難存活這麼長時間，因此可以提高最終獲得的BMDC的純度；
f. 此方法僅利用GM-CSF進行誘導培養，所得的BMDC包含未成熟DC和成熟DC。為了進一步提高成熟度，再用LPS或TNF-α誘導1-2天，成熟DC細胞含量將達到50-70%。
【栽培步驟】
3.3.1 取得小鼠骨髓細胞
請參閱Inaba方法（修改後）對應步驟，注意應省略溶血步驟。
3.3.2 BMDC 的大規模製備
1） 計數步驟1中所得的小鼠骨髓細胞，調整細胞濃度為2×105/ml含10％FBS的RPMI 1640完全培養基；
2） 鋪於100mm細菌培養皿（Petri Dish），每皿10ml細胞，加入重組鼠GM-CSF（200 單位/毫升），37℃、5％CO2培養箱培養；
[筆記] 這裡使用的是細菌培養皿，而不是細胞培養板。
3） 第3天，加入10ml含有20 納克/毫升 將重組鼠GM-CSF移至培養皿中；
4） 在第6天和第8天，更換一半培養基，即收集舊培養基，用含有20 納克/毫升 離心後回收重組鼠GM-CSF，然後將細胞懸浮液放回原皿中；
5） 第十天即可收集細胞，即為BMDC。
3.3.3 BMDC 完全成熟
1） 培養第10天，用移液管輕輕吹打DC，收集懸浮細胞，室溫300xg離心5分鐘；
2） 棄上清，以10ml RPMI 1640完全培養基重懸細胞沉澱，再鋪於100mm細胞培養板；
3） 加入重組小鼠 GM-CSF (100 單位/毫升) 和 TNF-α (500 單位/毫升)或重組小鼠GM-CSF(100 單位/毫升)和LPS(1 毫克/毫升）；
4） 繼續在37℃、5% CO2 中培養2 孵化器內培養 1-2 天。
4. BMDC 的鑑定
公升 形態學觀察：BMDC多數呈集落狀生長，細胞內有多個樹突突起，在成熟的BMDC中更為明顯。
公升 細胞表型分析：流式細胞儀檢測DC細胞表面CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ類分子（IA/IE）的表達。 BMDC高度表達這些分子，在完全成熟的BMDC中這些分子的表達會進一步增加。
公升 混合淋巴球反應（MLR）：BMDC具有較強的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越強。
5. 如何選擇成熟誘導劑？
LPS、CD40L 和 TNF-α 是人類 DC 和小鼠 DC 常用且有效的成熟誘導劑。 TNF-a誘導DC成熟的能力在三者中是最弱的。 LPS 和 CD40L 都是體外 DC 完全成熟的強效誘導劑。兩者誘導DC的成熟過程相似，但誘導的細胞激素譜不同。 CD40L誘導的成熟BMDC在體內表現出最強的免疫調節能力，包括產生保護性和治療性腫瘤免疫反應。用LPS刺激DC完全成熟的濃度一般為1-10 μg/mL，但實際上0.1 μg/mL的效果已經非常強了，但為了保險起見，1 一般以μg/mL表示。需要注意的是，CD40L分子屬於TNF配體家族，其特徵是只有形成三聚體後才能發揮作用。所以最好用重組CD40L三聚體蛋白來刺激DC，會有很好的效果。如果用CD40L單體來刺激DC，大多數情況下成熟度不是很高。
6. 訓練方式的選擇
表 1.三種製備BMDC的常見實驗方法比較
| 範圍 | 經典的BMDC培養方法-Inaba方法 | BMDC的大規模製備-Son法 | BMDC的大規模製備-Lutz法 |
| PubMed 中的引用次數 | 783 | 24 | 663 |
| 骨髓溶血、紅血球溶解 | 是的 | 是的 | 不 |
| 骨髓首先清除淋巴球 | 是的 | 不 | 不 |
| 培養過程中去除粒細胞 | 是的 | 不 | 不 |
| 骨髓細胞的初始接種體積 | 1毫升 | 15毫升 | 10毫升 |
| 孵化器 | 24 孔細胞培養板 | 6孔細胞培養板 | 100mm細菌培養皿 |
| 培養基 | RPMI1640+10% 胎牛血清 | ||
| 小鼠 GM-CSF 濃度 | 200-1000 單位/毫升 | 初始添加濃度為125-1000 單位/毫升 第4天和第7天在培養系統中加入足量的GM-CSF和IL-4。 | 初始添加濃度為200 單位/毫升。3-100 單位/毫升 第十天后 |
| 小鼠IL-4 | 不必 | 需要，濃度與GM-CSF相同 | 不必 |
| 液體交換法 | 第2天和第4天棄去50%～75%的舊培養基（其中含有細胞），換成含有足量GM-CSF的新鮮完全培養基。 | / | 第3天加入等體積含有GM-CSF的完全培養基。第6、8、10天更換一半培養基。將舊培養基（含細胞）吸出、離心，重新懸浮在含有 GM-CSF 的新鮮完全培養基中，然後放回。 |
| 傳代前培養時間（擴增） | 6天 | 7 天 | 10 天 |
| 傳代後培養時間（成熟） | 2 天 | 沒有任何 | 1-2天 |
| 成熟誘導劑 | TNF-α（250 單位/毫升） | 脂多醣(1-10 微克/毫升） | TNF-α（250 單位/毫升）或 LPS(1 微克/毫升） |
| DC細胞採集時間 | 7-8天 | 7-8天 | 10-13天 |
| 直流純度 | 第 8 天：60-70% | 第 7 天：85-95％ | 第 10-12 天：80-90％ |
| DC 生產/小鼠 | （5-7）×106 | （3-4）×107 | （1-3）×108 |
7. 推薦的DC培養試劑
| 產品名稱 | 貓 | 尺寸 |
| 91108ES | 5 微克/50 微克/100 微克/500 微克 | |
| 90144ES | 5 微克/50 微克/100 微克/500 微克 | |
| 90621ES | 5 微克/20 微克/50 微克/500 微克 | |
| 94016ES | 二十五 微克/100 微克/500 微克 |