科學家使用哪種酵素來結合新基因？不用說，其中包括DNA連接酶。那麼為什麼DNA連接酶在重組DNA中如此重要？因為DNA連接酶負責將目標片段連接到載體上，這是決定實驗成功的關鍵要素之一。 T4 DNA連接酶作為一種DNA連接酶，在分子克隆實驗中扮演什麼角色？它是如何運作的？接下來將詳細介紹T4 DNA連接酶。

1.什麼是T4 DNA連接酶？
2. T4 DNA連接酶的作用是什麼？
3. Yeasen Biotech T4 DNA 連接酶可用於 NGS 接頭連接
4. 選擇指南 Yeasen Biotech T4 DNA 連接酶

1.什麼是T4 DNA連接酶？

T4 DNA連接酶是一種ATP依賴性連接酶，能催化DNA分子間的連接反應。它主要透過連接3'-羥基和5'-磷酸端形成磷酸二酯。 DNA連接酶參與所有生物體的DNA複製和修復過程。噬菌體編碼的T4 DNA連接酶是在噬菌體T4感染大腸桿菌期間產生的。
基因工程中所使用的連接酶主要有大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶，目前後者應用更為廣泛。 T4 DNA連接酶可以修復雙股DNA、雙股RNA或DNA/RNA雜交鏈上的單股切口，連接兩個鄰近的核苷酸，在DNA修復和重組中扮演重要角色。
在重組質粒建構過程中，T4 DNA連接酶可以與限制性內切酶一起使用，完成重組質粒建構實驗。能催化雙股DNA5'-P端與3'-OH端形成磷酸二酯鍵，對黏端連接和平端連接均有良好的連接效率。

圖 1. T4 DNA 連接酶機制

2. T4 DNA連接酶的作用是什麼？

2.1 載體構建

在載體建構實驗中，不同的限制性酵素可以產生不同類型的末端。針對不同的末端，T4 DNA連接酶會有不同的連接策略。

2.1.1 以限制性酵素進行克隆，單次消化產生黏性末端

在載體建構過程中，如果使用相同的限制性內切酶切割目的基因的DNA片段，且載體分子能產生相同的黏性末端，則可用T4DNA連接酶直接進行重組連接。但由於黏性末端相同，目的基因可以正向或反向插入載體，容易增加篩選正確重組克隆的工作量。考慮使用雙酵素消化法進行載體建構。
此外，透過單酶切製備的載體的黏性末端也可進行配對，然後在T4 DNA連接酶的作用下，核苷酸間形成磷酸二酯鍵，導致載體的自身連接。使用鹼性磷​​酸酶處理消化後的載體，可以移除載體5’端的磷酸基團，使載體無法完成自身連接。這樣在T4 DNA連接酶的作用下，載體與目的片段連結起來，完成重組載體的建構。

2.1.2 用限制酶進行克隆，透過雙重消化產生黏性末端

在載體建構過程中，如果使用兩種具有不同黏末端的限制性酵素分別酶切目的片段和載體，則可以產生兩種不同的黏末端。此時，T4 DNA連接酶可以選擇性地連接相同的黏性末端，以確保目標片段以正確的方向插入載體。當圖2中的目的片段和載體同時用EcoR I和BamH I酶切時，可以連接成相同的黏性末端。目標片段與載體之間的連接方向只有一個。

圖 2. 雙酶切產生的黏端連接^[1]

2.1.3 限制性片段的克隆，平末端

一些限制性內切酶（例如 Sma I 等）在酶切過程中也可以產生平端。 T4DNA連接酶可直接在載體和插入片段之間形成磷酸二酯鍵，無需鹼基配對。但此方法連接效率較低，且容易發生載體自連接。通常，可以將平末端轉換為黏末端，然後進行連接。例如在目標片段和載體末端分別添加互補的poly A和poly T鹼基以及人為黏性的互補末端，透過末端脫氧核苷酸轉移酶提高連接效率。

2.1.4 TA克隆

TA克隆中使用的T載體在3'端有一個T突出端。當目的片段DNA序列不清楚時，可以透過TA克隆的方法將目的基因片段連接到T載體上，再透過定序確定目的基因。 PCR中使用的Taq DNA聚合酶具有末端轉移酶活性，可以在DNA片段的3'端添加核苷酸「A」。 T4 DNA連接酶可將Taq DNA聚合酶擴增的產物直接連接到T載體上，PCR擴增產物無需添加人工接頭即可達到高效克隆的目的。

圖3. TA克隆的工作流程^[2]

2.2 NGS 接頭連接

在建構二代定序文庫時，需要將人工接頭與PCR產物連接起來，然後才能固定在定序晶片上的Flow Cell上，完成定序。 TA克隆連接子文庫建構是一種很常見的技術手段，其原理與上述TA克隆類似。待定序的DNA片段在5’端經過磷酸化並在3’端添加“A”後，與帶有“T”黏性末端的接頭互補配對。然後，機器會形成完整的雙鏈並進行定序。
在TA連接過程中，不同的樣本類型或核酸片段結構的複雜程度都會影響連接的效率，因此不同平台的adapter也會對最終的建庫結果產生影響。
例如華大智造平台的Bubble adapter具有特殊的二級結構，對T4 DNA連接酶的連接效率要求非常高，連接效率的降低直接影響文庫的產出。

圖 4. 通用接頭連接流程

3. Yeasen Biotech T4 DNA 連接酶可用於 NGS 接頭連接

Yeasen 專門開發的生物技術 快速 T4 DNA 連接酶 用於NGS文庫建構過程中DNA片段與接頭的連接。該酵素具有高效的連接能力，不僅連接速度快而且相容於多種類型的樣本，更有利於結構複雜的核酸片段的連接。目前已通過大量客戶高通量定序驗證。對於MGI平台上Bubble適配器的連接，同樣可以獲得優異的定序品質。

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA 連接酶具有超高連接效率

使用 Yeasen Biotech Fast T4 DNA 連接酶用於建立具有不同適配器類型的文庫。樣本為170 bp的cfDNA模擬物，採用Agilent 2100文庫檢測結果。 ①未連接的適配器產品； ②單端適配器產品； ③雙端適配器產品； ④殘留適配器。從結果可以看出，單端和雙端接頭的連接效率都很高。

圖 5. Agilent 2100 偵測到的不同類型的連接產物

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA 連接酶，具有優異的文庫產量

使用Fast T4 DNA連接酶進行不同類型的文庫構建，與其他T4 DNA連接酶相比，文庫產量更佳。

表 1. 不同類型樣本的文庫產量

4. 選擇指南 Yeasen Biotech T4 DNA 連接酶

Yeasen 是一家從事分子、蛋白質、細胞三大生物試劑研發、生產和銷售的生物技術公司。除了 Fast T4 DNA 連接酶之外， Yeasen 生物技術也有 新型 T4 DNA 連接酶 和 快速T4 DNA連接酶 可供選擇。您可以根據下表所示的應用程式進行選擇：

表 2：相關產品

參考

[1] 袁文.基因工程[M].化學工業出版社，2019。
[2] Clark DP、Pazdernik NJ、Mcgehee M R. 克隆合成生物學基因 - ScienceDirect[J]。分子生物學（第三版），2019：199-239。
[3] Tomkinson AE、Vijayakumar S、Pascal JM 等人。 DNA 連接酶：結構、反應機制與功能[J]。化學評論，2006，106（2）：687-699。
[4] Shuman S. DNA連接酶: 進展與展望[J].生物化學雜誌，2009,284（26）：17365-17369。