- 背景
本報告中總結的數據由
彙總資料僅供使用者參考，使用者需以自己的樣本對支原體方法進行驗證，確認該方法能否滿足使用者的要求。建議所有使用該試劑盒的實驗室驗證以下參數：檢測極限、特異性和穩健性。
驗證內容：
| 表現 | 驗證參數 | 驗證結果 |
| 檢測極限 | 支原體菌株檢測極限 | 藥典規定的10種支原體檢測極限為10CFU/mL,每種檢測24次,檢出率≥95%。 |
| 特異性 | 樣品基質幹擾 | 測試了 9 種不同的樣本基質和 DNA 稀釋溶液，未檢測到支原體。 |
| 交叉反應 | 檢測了生物製藥中14株菌株及6種常用工程細胞，均未檢出支原體。 | |
| 耐用性 | 凍融穩定性 | 可承受20次重複凍融循環而不會影響套件性能。 |
| 熱加速穩定性 | 在37°C條件下保存14天以及4°C條件下保存30天不受影響。 | |
| 儀器相容性 | 與 ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96 和 Roche LightCycler®480 相容。 | |
| 覆蓋範圍 | 支原體 DNA 類型的覆蓋範圍 | 使用支原體 16S rRNA 序列的資料庫比較涵蓋了柔膜菌綱內的 183 個物種。 |
- 實驗材料與方法
2.1 麥克拉威商標 支原體即時 qPCR 檢測試劑盒 (2G)，供應商：
2.2 分子純商標 磁性殘留 DNA 樣本製備試劑盒，供應商：
2.3 支原體敏感性標準品購自Minerva Biolabs（MB），其菌株來自國家典型培養物保藏中心（NCTC）。靈敏度標準品為滅活支原體，用於支原體檢測核酸擴增法（qPCR/PCR法）的方法學驗證。共購買10種支原體，符合EP 2.6.7和JP G3的要求。標準資訊如下：
| 小販 | 貨號 | NCTC 編號 | 熱帶氣旋中心 不。 | 材質名稱 |
| Minerva 生物實驗室（MB） | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 精胺酸支原體 |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 口腔支原體 | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 雞毒支原體 | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 肺炎支原體 | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 滑液支原體 | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 發酵支原體 | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 豬鼻支原體 | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 萊氏無膽固醇原體 | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ 靈敏度標準 柑橘螺旋體 | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10菌落形成單位™ 靈敏度標準 唾液支原體 |
2.4 原文資料：電子版記錄於《實驗報告》 父檔案「MycAway」的子文件商標 支原體實時 qPCR 檢測試劑盒（2G）'。
2.5 方法：實驗所用材料及操作方法基本由
- 資格審查內容及結果
3.1 檢測極限（LOD）
依照10 CFU/mL支原體標準菌株說明書及萃取及檢測試劑盒說明書進行核酸萃取及檢測。對 10 CFU/mL 支原體標準菌株共進行了 24 次檢測。每次實驗同時測試 NCS（陰性對照樣本）和 NTC（無模板對照）樣本。
結果顯示，NCS和NTC結果令人滿意，24個104CFU/mL樣本全部檢測呈陽性，符合24次檢測中至少有23次呈陽性的要求。
| 不。 | 材質名稱 | 菌液濃度 |
| 1 | 精胺酸支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 2 | 口腔支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 3 | 雞毒支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 4 | 肺炎支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 5 | 滑液支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 6 | 發酵支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 7 | 豬鼻支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 8 | 無膽固醇原體 萊德勞 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 9 | 柑橘螺旋體 | 10菌落形成單位/毫升 |
| 10 | 唾液支原體 | 10菌落形成單位/毫升 |
表 1 已驗證菌株的信息
| 10菌落形成單位/毫升 | 實驗 1 | 實驗 2 | 實驗 3 |
| 檢測率 | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| 全部的 | 24/24 | ||
表2 檢測極限結果
3.2 特異性
3.2。1 支原體檢測範圍
將試劑盒中的引子探針序列與資料庫中的16S rRNA基因組進行比較。經生物資訊分析，獲得MycAway商標 NextSense Biologicals 的支原體 qPCR 檢測試劑盒（探針法）可以覆蓋至少 183 種蟲黃藻，其中包括 120 種支原體、9 種脲原體、33 種螺旋體和 7 種膽囊線蟲等。
3.2。2 樣品基質幹擾
9 種底物（Dulbecco 的 MEM、Ham 的 F-10 培養基、M-199 培養基、Ham 的 F-12K Kaighn 的培養基、RPMI-1640 培養基、McCoy 的 5A、Ham 的 F-12K Kaighn 的 +1.0mM/L MED/L 2572 -25 +19253 林谷氨酰胺/L MED.S.05 mM L-Glutamine、DMEM-低糖標準培養基)為樣品驗證樣品基質幹擾,結果顯示該培養基對試劑盒試劑無幹擾。
3.2。3 屈撓桿菌檢測範圍
需要萃取並檢測 10 CFU/mL 的滅活支原體（精氨酸支原體、口腔支原體、雞毒支原體、肺炎支原體、滑膜支原體、發酵支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽汁支原體、柑橘螺原體、唾液支原體），以及 NCS 和 NTC 樣本測試。
結果顯示，NCS、NTC均未檢出，結果為陰性； 10種支原體全部檢測，結果均為陽性。
3.2。4 交叉反應
對於包括梭狀芽胞桿菌（梭狀芽胞桿菌），包括梭狀芽胞桿菌的14個非黴菌菌株，乳酸桿菌（乳酸乳桿菌），鏈鏈球菌（鏈球菌突變，鏈球菌，肺炎鏈球菌）埃托桿菌，腸桿菌，藤黃，銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌，白細胞桿菌腸腸桿菌， interica entrica entrica entrica interica entrica interica enterica entrica 293T，Vero，Cho，E.Coli，SF9）用於使用Molpure進行支原體檢測商標 磁珠法殘留DNA樣本預處理試劑盒（瓶裝）及MycAway商標 支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）（2G），每個實驗與PCS、NCS、NTC樣本檢測同時進行。
結果表明，PCS、NCS、NTC結果令人滿意；檢測樣本結果為陰性，未發生交叉反應。
3.3 穩健性
3.3.1 凍融穩定性
將支原體檢測試劑盒在-25℃~-15℃條件下進行凍融實驗，結果顯示，該試劑盒可承受20次反覆凍融，性能不受影響。
3.3。2 加速穩定性
支原體檢測試劑盒分別在37℃熱加速14天和4℃熱加速30天，結果顯示產品性能不受影響。
3.3。3 儀器適用性
對於支原體檢測試劑盒，以試劑盒中不同濃度的陽性對照和肺炎支原體DNA作為待測樣本，分別在Thermo Scientific ABI7500、Thermo Scientific ABI Q5、上海宏實SLAN-96S、Roche LightCycler®480四個不同品牌和型號的儀器上進行實驗。實驗在上海宏實SLAN-96S、Roche LightCycler®480四種不同品牌與型號的qPCR儀上進行。
結果顯示，待測樣本在不同廠商型號的qPCR儀上進行檢測，陰性對照結果均合格，試劑盒性能未受影響。
- 4。參考
4.1 支原體檢查方法<3301>。中國藥典第三部[S].北京: 中國科學技術出版社, 2020: 542-543。
4.2 分析方法驗證指引<9101>。中國藥典第三部[S].北京：中國科學技術出版社,2020:682。
4.3 藥品微生物檢測替代方法驗證指引<9201>。中國藥典第三部[S].北京：中國科學技術出版社,2020:684。
4.4 支原體。歐洲藥典[S].第 10 版，2020 年：第 2.6.7 節，194-199。
4.5 用於生物技術/生物製品生產的細胞基質的支原體檢測<G3-14-170>。日本藥典[S].第 18 版，2021 年：2678-2682。
4.6 Erica J. Fratz-Berilla、Phillip Angart、Ryan J.Graham 等人故意發生支原體污染事件對 CHO 細胞生物反應器培養中產生的單株抗體產物品質屬性的影響。生物技術和生物工程。 2020；117(9): 2802-2815。
4.7 Dmitriy V. Volokhov、Laurie J Graham、Kurt A Brorson、Vladimir E Chizhikov。細胞底物和生物製劑的支原體檢測：替代非微生物技術的回顧。 Mol 細胞探針。 2011年4月-6月;25(2-3):69-77。
4.8 AL Ingebritson、CP Gibbs、C. Tong 和 GB Srinivas。一種檢測獸用疫苗及生物製品支原體污染的PCR檢測方法。應用微生物學快報。 2015年2月;60(2):174-180。
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