膽固醇 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒 （3）格）
資格概要（編號： 41332ES60）
- 背景
本報告中總結的數據由
- 實驗材料與方法
2.1 膽固醇 宿主細胞 DNA 殘留檢測試劑盒 (3G)，供應商：
2.2 MolPure 磁性殘留 DNA 樣本製備試劑盒，供應商：
2.3 原文資料：電子版記錄於《實驗報告》 父文件的子文件 膽固醇 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）。
2.4 方法：實驗所用材料及操作方法基本由
- 資格審查內容及結果
3.1 檢測範圍
試劑盒的線性範圍為3 fg/μL~300 pg/μL，R2=1，擴增效率為99.09%，各濃度檢測的CV<15%。
圖 1 CHO DNA (3G) qPCR 標準曲線
3.2 準確性
3.2。1 R生態恢復
3.2.1.1 空白樣品加標回收率實驗
CHO 樣本 高、低濃度 DNA 標準：30 皮克/微升, 300 分別製備100、200、300 fg/μL、300、400 fg/μL樣品，以磁珠法殘留DNA樣本預處理試劑盒（3 每個樣品進行10次重複萃取，每次萃取進行3次重複測定），並分析樣品回收率和CV。
對於不同濃度的DNA樣品，回收率為70%~130%，CV均<20%。
| 樣品類型 | 理論濃度 | 提取 1 個均值 | 提取 2 個均值 | 提取 3 個均值 | 平均濃度 | 履歷 | 恢復 |
| 空白樣品 | / | / | / |
| / | / | / |
| 恢復範例 1 | 30 皮克/微升 | 27.07 | 27.51 | 28.27 | 27.62 | 2.20% | 92.06％ |
| 恢復範例 2 | 300 克/微升 | 285.53 | 301.25 | 295.71 | 294.16 | 2.71％ | 98.05％ |
| 恢復範例 3 | 3微克/微升 | 3.50 | 3.54 | 3.31 | 3.45 | 3.56% | 115.00% |
表1 空白樣品加標回收率
3.2.1.2 模擬樣品加標回收實驗
以 5 種不同的背景溶液（高蛋白、高核酸、高和低 pH、高鹽）萃取相同濃度（300 fg/μL CHO DNA）的樣品（每個樣品進行 3 次萃取重複，每次萃取進行 3 次測定重複），並分析樣品回收率和 CV。
不同背景溶液的 DNA 樣本回收率範圍為 70% 至 130%，所有 CV 均 <20%。
| 樣品類型 | 理論濃度 | 提取 1 個均值 | 提取 2 個均值 | 提取 3 個均值 | 平均濃度 | 履歷 | 恢復 |
| 基本範例 | / | / | / |
| / | / | / |
| 高蛋白 | 300 微克/微升 | 302.29 | 332.86 | 342.76 | 325.97 | 6.47％ | 108.66% |
| 高核酸 | 284.47 | 290.66 | 308.76 | 294.63 | 4.28％ | 98.21％ | |
| 高鹽 | 272.96 | 286.25 | 312.91 | 290.71 | 7.00％ | 96.90％ | |
| 高 pH 值 | 296.04 | 320.58 | 324.56 | 313.72 | 4.92％ | 104.57% | |
| 低 pH 值 | 314.77 | 327.89 | 340.26 | 327.64 | 3.89％ | 109.21％ |
表 2 基本樣品加標回收率
3.3 精度
3.3.1 重複性
濃度為 3 fg/μL 的 CHO DNA 標準重複測定 10 次，CV <15%。
| 重複 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 意思是 | 履歷％ |
| 檢測值 (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2.89 | 3.16 | 2.95 | 2.87 | 2.88 | 2.75 | 2.87 | 3.15 | 2.99 | 5.65％ |
表3 重複性結果
3.3。2 中間精度
三位實驗人員獨立檢測了高、低濃度的CHO DNA標準樣本：300 pg/μL、3 pg/μL、3 fg/μL，每個濃度做了三次重複實驗，所得九個數據的CV均<15％。
| 經驗值 |
實際濃度 理論濃度 | CHO DNA（3G） | ||
| 300 皮克/微升 | 3皮克/微升 | 3微克/微升 | ||
| 實驗 1 | 決定 1 | 302.63 | 2.97 | 3.40 |
| 決定 2 | 294.54 | 3.01 | 3.14 | |
| 決定 3 | 287.67 | 2.99 | 3.01 | |
| 實驗2 | 決定 4 | 292.27 | 2.92 | 3.四十七 |
| 決定 5 | 299.61 | 2.90 | 2.82 | |
| 決定 6 | 305.73 | 2.93 | 2.90 | |
| 實驗 3 | 決定 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| 決定 8 | 299.17 | 3.00 | 3.21 | |
| 決定 9 | 290.66 | 2.90 | 3.05 | |
| / | 意思是 | 297.04 | 2.98 | 3.13 |
| / | 履歷％ | 2.03 | 2.80 | 6.85 |
表4 中間精密度結果
3.4 特異性
對生物製品生產中常用的細胞基因組DNA對CHO DNA檢測試劑的干擾進行了評價，幹擾組與對照組重疊，未見到干擾（下圖依次為小鼠、MDCK、HEK293、E.coli基因組DNA對CHO DNA檢測試劑的干擾數據）。
圖2 幹擾實驗結果
3.5 定量限
以 3 fg/μL、1 fg/μL、0.5 fg/μL、0.3fg/uL 和 0.1 fg/μL 的濃度檢測 CHO DNA，每個濃度重複 10 次。結果表明，濃度為0.3 fg/μL及以上時，CV<20%。即CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）的定量極限為0.3fg/μL。
|
重複 測試項目 | CHO DNA（3G） （fg/μL） | |
| 數量 | 重算比率% | |
| 1 | 0.28 | 93.33% |
| 2 | 0.26 | 86.67％ |
| 3 | 0.32 | 106.67% |
| 4 | 0.30 | 100.00% |
| 5 | 0.33 | 110.00% |
| 6 | 0.23 | 76.67％ |
| 7 | 0.29 | 96.67％ |
| 8 | 0.37 | 123.33% |
| 9 | 0.31 | 103.33% |
| 10 | 0.28 | 93.33% |
| 意思是 | 0.30 | / |
| 履歷％ | 13.09％ | / |
圖 3. CHO DNA (3G) qPCR 檢測結果
3.6 檢測極限
檢測濃度為 0.3 fg/μL、0.1 fg/μL、0.05 fg/μL 和 0.01 fg/μL 的 CHO DNA，各濃度重複 20 次。結果顯示，在0.05 fg/μL以上的濃度下，20個重複孔中的檢出率≥19（即檢出率≥95%）。即CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）的檢測極限為0.05fg/μL。
圖 4. CHO DNA (3G) qPCR 檢測結果
3.7 穩健性
本套件經過測試，適用於（但不限於）以下儀器：
| 小販 | 儀器型號 | 擴增效率 | R2 | 定量限 | 履歷 | 檢測極限 | 檢測率 |
| 熱 | 澳洲商業資訊局 7500 | 99.69％ | 1 | 0.3 微克/微升 | 12.40％ | 0.05 微克/微升 | 95.65％ |
| 熱 | ABI QuantStudio5 | 99.26％ | 1 | 0.3 微克/微升 | 15.30％ | 0.05 微克/微升 | 100.00% |
| 羅氏 | LightCycler480 | 2.05％ | 0.978 | 0.3 微克/微升 | / | 0.05 微克/微升 | / |
| 上海紅石 | 斯蘭 | 101.14％ | 0.999 | 0.3 微克/微升 | 14.41％ | 0.05 微克/微升 | 95.65％ |
表5 儀器適用性試驗結果
3.8 穩定性
3.8.1 凍融穩定性
CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）經10次反覆凍融測試，試劑盒性能未受影響。
|
測試指標 凍融時間 | 範圍 | T0時間 | 凍融10次 |
| 標準曲線參數 | 擴增效率 | 95.70% | 98.62％ |
| R2 | 1 | 1 | |
| 定量限 (0.3 fg/μL) | 履歷 | 15.31％ | 17.16％ |
| 檢測極限 (0.05 fg/μL) | 檢測率 | 95.65％ | 100％ |
表6 凍融穩定性結果分析
3.7。2 加速穩定性
CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）分別在2~8°C下保存30天、37°C保存14天。該套件的所有性能均未受到影響。
|
測試指標 加速溫度和時間 | 範圍 | 實驗 1 | 實驗 2 | ||
| T0時間 | 2~8℃ 30 天 | T0時間 | 37℃ 14天 | ||
| 標準曲線參數 | 擴增效率 | 100.53% | 102.61％ | 101.76％ | 101.84％ |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 定量限 (0.3 fg/μL) | 履歷 | 17.16％ | 12.63％ | 16.27％ | 12.49 |
| 檢測極限 (0.05 fg/μL) | 檢測率 | 95.65％ | 100％ | 95.57％ | 100％ |
表7 加速穩定性結果分析
3.9 空白限量
3.9.1 無模板對照 (NTC)
無模板對照（NTC）是對DNA稀釋液進行96次重複進行qPCR定量檢測，所檢測的96個重複孔中所有CT值均>40。
圖5 NTC實驗結果
3.9。2 陰性萃取對照樣本 (NCS)
陰性萃取對照樣本（NCS）為DNA稀釋液，先透過樣本預處理萃取，再進行qPCR，檢測的48個重複孔中所有CT值均>40。
圖 6 國家電腦系統公司 實驗結果
- 4。參考
4.1 國家藥典委員會（ChPC）。中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，p.542-543，2020年。
4.2國家藥品監督管理局，2007年：《生物製品品質管制分析方法驗證技術審查通則》。
4.3 ICH(2022)《分析方法驗證Q2》，徵求意見稿。
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| MycAway™ 支原體 qPCR 檢測試劑盒 (2G) | 40619ES |
