HEK293宿主細胞DNA殘基檢測試劑盒（3G）驗證報告

HEK293 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒 （3）格）

資格摘要（類別編號：41331ES60）

1. 背景

本報告中總結的數據由 Yeasen 'HEK293 的生物技術 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）' 產品。匯總資料僅供用戶參考，用戶需自行驗證宿主細胞殘留 DNA方法透過使用自己的樣本來確認該方法是否可以滿足使用者的要求。建議所有使用此試劑盒的實驗室驗證以下參數：線性、範圍、準確度、精確度、定量限、特異性和穩健性。

Yeasen 生物技術可以提供此試劑盒的詳細鑑定報告。如果使用者使用此報告，則只有適用性（包括精確度、 準確性 應驗證其有效性和特異性。

2. 實驗材料與方法

2.1 HEK293 宿主細胞 DNA 殘留檢測試劑盒 (3G)，供應商： Yeasen，貨號：41331ES60。

2.2 MolPure® 磁性殘留 DNA 樣本製備試劑盒，供應商： Yeasen，貨號：18461ES60。

2.3 原文資料：電子版記錄於《實驗報告》 父檔“HEK293 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）'。

2.4 方法：實驗所用材料及操作方法基本由 Yeasen 經過長期評估和驗證的生物技術，試劑盒的開發和生產均遵循ISO 13485系統。

3. 資格審查內容及結果

3.1 檢測範圍

試劑盒的線性範圍為30 fg/μL~300 pg/μL，R²≥0.998，擴增效率在90％～110％範圍內，各濃度測定的CV<15％。

圖 1 HEK293 DNA (3G) qPCR 標準曲線

3.2 準確性

3.2。1 R生態恢復

3.2.1.1 空白樣品加標回收率實驗

HEK293 樣品 分別製備高、低濃度DNA標準品：300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL，以磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒萃取後進行測定（每個樣本重複2次萃取，每次萃取重複3次測定），並分析樣本回收率及CV。

對於不同濃度的DNA樣品，回收率為70%~130%，CV均<20%。

樣品類型	理論濃度	提取 1 個均值	提取 2 個均值	平均濃度	履歷	恢復
空白樣品	/	/	/	/	/	/
恢復範例 1	300 皮克/微升	306.81 皮克/微升	279.57 皮克/微升	293.82 皮克/微升	6.56%	97.94％
恢復範例 2	3皮克/微升	3.11 皮克/微升	2.99 皮克/微升	3.09 皮克/微升	2.75％	103.00%
恢復範例 3	30 微克/微升	31.02 克/微升	30.63 克/微升	30.83 克/微升	0.89％	102.77％

表1 空白樣品加標回收率

3.2.1.2 模擬樣品加標回收實驗

以 5 種不同的背景溶液（高蛋白、高核酸、高和低 pH、高鹽）萃取相同濃度（3 pg/μL HEK293 DNA）的樣本（每個樣本進行 2 次萃取重複，每次萃取進行 3 次測定重複），並分析樣本回收率和 CV。

不同背景溶液的 DNA 樣本回收率範圍為 70% 至 130%，所有 CV 均 <20%。

樣品類型	理論濃度	提取 1 個均值	提取 2 個均值	平均濃度	履歷	恢復
基本範例	/	/	/	/	/	/
高蛋白	3皮克/微升	2.65	2.80	2.73	3.80％	90.87％
高核酸		2.82	2.97	2.90	3.71％	96.58％
高鹽		2.88	2.70	2.79	4.47％	92.89％
高 pH 值		2.81	2.93	2.87	2.98％	95.71％
低 pH 值		2.76	2.79	2.77	0.99％	92.48％

表 2 基本樣品加標回收率

3.3 精度

3.3.1 重複性

濃度為 30 fg/μL 的 HEK293 DNA 標準重複測定 10 次，CV <15%。

重複	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	意思是	履歷％
檢測值 (fg/μL)	29.51	30.02	30.13	30.16	27.99	31.01	31.05	30.95	31.02	29.86	30.17	3.15％

表3 重複性結果

3.3。2 中間精度

三位實驗人員獨立檢測了高、低濃度300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL的HEK293 DNA標準樣品，每個濃度做了三次重複實驗，所得九個數據的CV均<15％。

經驗值	實際濃度 理論濃度	HEK293 DNA (3G)
		300 皮克/微升	3皮克/微升	30 微克/微升
實驗 1	決定 1	319.58	3.026	32.02
	決定 2	309.76	3.051	37.01
	決定 3	309.24	3.067	36.03
實驗 2	決定 4	308.34	2.909	29.91
	決定 5	308.54	2.9	29.67
	決定 6	305.83	2.921	28.85
實驗 3	決定 7	299.11	3.035	29.36
	決定 8	300.07	2.833	31.14
	決定 9	302.03	3.033	33.07
/	意思是	306.95	2.975	31.90
/	履歷％	2.03%	2.83%	9.26%

表4 中間精密度結果

3.4 特異性

對生物製品生產中常用的細胞基因組DNA對HEK293 DNA檢測試劑的干擾進行了評價，幹擾組與對照組重疊，未見到干擾（下圖依次為CHO、E.coli、Pichia Pastoris基因組DNA對HEK293 DNA檢測試劑的干擾數據）。

圖2 幹擾實驗結果

3.5 定量限

以 30 fg/μL、20 fg/μL、10 fg/μL 和 5 fg/μL 檢測 HEK293 DNA，每個濃度重複 10 次。結果表明，濃度為10 fg/μL及以上時，CV<20%。即HEK293宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）的定量極限為10fg/μL。

重複 測試項目	HEK293 DNA（3G）（fg/μL）
	數量	重算比率%
1	11.04	110.40%
2	9.97	99.70％
3	11.12	111.20％
4	11.07	110.70%
5	11.21	112.10％
6	9.93	99.30％
7	10.25	102.50％
8	10.16	101.60%
9	10.08	100.80%
10	10.11	101.10%
意思是	10.49	/
履歷％	5.14％	/

圖3 10fg/μL HEK293 DNA (3G) qPCR檢測結果

3.6 穩健性

本套件經過測試，適用於（但不限於）以下儀器：

小販	儀器型號	擴增效率	R2	定量極限（fg/μL）	履歷％
熱	澳洲商業資訊局 7500	102.84％	1	10	7%
熱	ABI QuantStudio5	104.70％	0.999	10	9％
上海紅石	斯蘭	101.46%	0.999	10	8%

表5 儀器適用性試驗結果

3.7 穩定性

3.7.1 凍融穩定性

HEK293宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）經10次重複凍融測試，試劑盒性能未受影響。

測試指標 凍融時間	範圍	T0時間	凍融10次
標準曲線參數	擴增效率	99.34％	100.78％
	R2	1	1
定量限（30 fg/μL）	履歷	11%	7%

表6 凍融穩定性結果分析

3.7。2 加速穩定性

HEK293宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（3G）分別在2~8°C下保存30天、37°C​​保存14天。該套件的所有性能均未受到影響。

測試指標 加速溫度和時間	範圍	T0時間	37℃ 7天	37℃ 14天
標準曲線參數	擴增效率	103.83%	101.58％	100.47%
	R2	0.999	1	1
定量限（30 fg/μL）	履歷％	8%	5％	5％

表7 加速穩定性結果分析

3.8 空白限量

無模板對照 (NTC) 是模板稀釋液，96 次重複 CT 值 >32（加上 ROX 校準閾值線設定為 0.06）。

圖4 NTC實驗結果

4. 4。參考

4.1 國家藥典委員會（ChPC）。中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，p.542-543，2020年。

4.2國家藥品監督管理局，2007年：《生物製品品質管制分析方法驗證技術審查通則》。

4.3 ICH(2022)《分析方法驗證Q2》，徵求意見稿。

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