大腸桿菌宿主細胞DNA殘基檢測試劑盒（2G）驗證報告

大腸桿菌 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒 （2G）

資格摘要（類別編號：41308ES60）

1. 背景

本報告中總結的數據由 Yeasen '大腸桿菌宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）'產品的生物技術。匯總資料僅供用戶參考，用戶需自行驗證宿主細胞殘留 DNA方法透過使用自己的樣本來確認該方法是否可以滿足使用者的要求。建議所有使用此試劑盒的實驗室驗證以下參數：線性、範圍、準確度、精確度、定量限、特異性和穩健性。

Yeasen 生物技術可以提供此試劑盒的詳細鑑定報告。如果使用者使用此報告，則只有適用性（包括精確度、 準確性 應驗證其有效性和特異性。

2. 實驗材料與方法

2.1 大腸桿菌宿主細胞 DNA 殘留檢測試劑盒 (2G)，供應商： Yeasen，貨號：41308ES60。

2.2 MolPure® 磁性殘留 DNA 樣本製備試劑盒，供應商： Yeasen，貨號：18461ES60。

2.3 大腸桿菌DNA含量國家標準：Cat. 270027，批號：201101，濃度：96.2 μg/mL，儲存條件：-70℃，購自：中國食品藥品檢驗研究院。

2.4 原文資料：電子版記錄於《實驗報告》 父親文件「大腸桿菌宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）」的子文件。

2.5 方法：實驗所用材料及操作方法基本由 Yeasen 經過長期評估和驗證的生物技術，試劑盒的開發和生產均遵循ISO 13485系統。

3. 資格審查內容及結果

3.1 檢測範圍

試劑盒的線性範圍為30 fg/μL~300 pg/μL，R²=1,擴增效率為101.74%,各濃度實驗CV<15%。

圖 1 大腸桿菌 DNA (2G) qPCR 標準曲線

3.2 準確性

3.2.1 偏離 大腸桿菌DNA含量國家標準

試劑盒中每批大腸桿菌DNA標準物質均以大腸桿菌DNA含量國家標準進行校正。 Yeasen DNA標準物質與大腸桿菌DNA含量國家標準基本無偏差 校準曲線，測定值偏差<5％。

3.2。2 R生態恢復

3.2.2.1 空白樣品加標回收率實驗

分別製備高、低濃度E.coli DNA標準樣本：300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL，以磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒萃取後測定（每個樣本重複2次萃取，每次萃取重複3次測定），分析樣本回收率及CV。

對於不同濃度的DNA樣品，回收率為70%~130%，CV均<20%。

樣品類型	理論濃度	提取 1 個均值	提取 2 個均值	平均濃度	履歷	恢復
空白樣品	/	/	/	/	/	/
恢復範例 1	300 皮克/微升	250.56 皮克/微升	262.11 皮克/微升	256.33 皮克/微升	4.41％	85.44％
恢復範例 2	3皮克/微升	2.29 皮克/微升	2.56 皮克/微升	2.42 皮克/微升	7.09％	80.77％
恢復範例 3	30 微克/微升	33.62 克/微升	32.61 克/微升	33.12 克/微升	14.28％	110.39％

表1 空白樣品加標回收率

3.2.2.2 模擬樣品加標回收實驗

以5種不同的背景溶液（高蛋白、高核酸、高和低pH、高鹽）萃取相同濃度（3 pg/μL E.coli DNA）的樣本（每個樣本進行2次重複萃取，每次萃取進行3次重複測定），並分析樣本回收率和CV。

不同背景溶液的 DNA 樣本回收率範圍為 70% 至 130%，所有 CV 均 <20%。

樣品類型	理論濃度	提取 1 個均值	提取 2 個均值	平均濃度	履歷	恢復
基本範例	/	/	/	/	/	/
高蛋白	3皮克/微升	2.25	2.23	2.24	1.09％	74.74％
高核酸		3.93	3.96	3.95	1.56％	131.52％
高鹽		2.69	2.67	2.68	2.63	89.20％
高 pH 值		2.90	3.67	3.二十九	13.82％	109.55％
低 pH 值		2.77	2.87	2.82	3.41％	94.01％

表 2 基本樣品加標回收率

3.3 精度

3.3.1 重複性

濃度為 3 pg/μL 的 E.coli DNA 標準重複測定 10 次，CV <15%。

重複	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	意思是	履歷
檢測值 (fg/μL)	3.16	2.87	2.97	2.86	2.81	2.97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4.78％

表3 重複性結果

3.3。2 中間精度

三位實驗人員獨立檢測了高、低濃度300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL的E.coli DNA標準樣品，每個濃度做了三次重複實驗，所得9個數據的CV均<15％。

經驗值	實際濃度 理論濃度	大腸桿菌 DNA (2G)
		300 皮克/微升	3皮克/微升	30 微克/微升
實驗 1	決定 1	295.65	3.22	26.90
	決定 2	287.71	3.24	32.00
	決定 3	300.23	3.17	27.50
實驗 2	決定 4	306.06	3.13	37.30
	決定 5	299.76	3.02	32.70
	決定 6	299.63	3.02	34.00
實驗 3	決定 7	266.70	3.01	35.90
	決定 8	272.89	3.09	40.70
	決定 9	276.51	3.01	35.20
/	意思是	289.46	3.10	33.60
/	履歷	4.89％	3.02%	13.18％

表4 中間精密度結果

3.4 特異性

對生物製品生產中常用的細胞基因組DNA對大腸桿菌DNA檢測試劑的干擾進行了評價，幹擾組與對照組重疊，未見到干擾（下圖依次為HEK293、Vero、CHO基因組DNA對大腸桿菌DNA檢測試劑的干擾數據）。

圖2 幹擾實驗結果

3.5 定量限

以 50 fg/μL、40 fg/μL、30 fg/μL、10 fg/μL 和 5 fg/μL 的濃度檢測大腸桿菌 DNA，每個濃度重複 10 次。結果表明，濃度為30 fg/μL及以上時，CV<20%。即E.coli宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）的定量極限為30fg/μL。

重複 測試項目	大腸桿菌 DNA (2G) (fg/μL)
	數量	重新計算比率
1	29.43	98.09％
2	29.51	98.35％
3	32.04	106.79％
4	26.07	86.89％
5	34.06	113.53%
6	33.54	111.79％
7	26.95	89.82％
8	27.38	91.26％
9	27.04	90.13%
10	26.10	87.02％
意思是	29.21	/
履歷	10.40％	/

圖3 30fg/μL E.coli DNA（2G）qPCR檢測結果

3.6 穩健性

本套件經過測試，適用於（但不限於）以下儀器：

小販	儀器型號	擴增效率	R2	定量極限（fg/μL）	履歷
熱	澳洲商業資訊局 7500	101.74％	1	三十	13.30％
熱	ABI QuantStudio5	100.46%	1	三十	12.40％
伯樂	CFX96	99.20％	0.999	三十	13.76％
上海紅石	斯蘭	100.40%	0.999	三十	11.67％

表5 儀器適用性試驗結果

3.7 穩定性

3.7.1 凍融穩定性

大腸桿菌宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）經10次重複凍融測試，試劑盒性能未受影響。

測試指標 凍融時間	範圍	T0時間	凍融10次
標準曲線參數	擴增效率	98.23%	100.20%
	R2	1	0.999
定量限（30 fg/μL）	履歷	15.07％	9.66%

表6 凍融穩定性結果分析

3.7。2 加速穩定性

E.coli宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）分別在2~8°C保存30天和37°C保存14天。該套件的所有性能均未受到影響。

測試指標 加速溫度和時間	範圍	實驗 1		實驗 2
		T0時間	2~8℃ 30 天	T0時間	37℃ 14天
標準曲線參數	擴增效率	97.77％	99.81％	98.39％	98.65％
	R2	1	1	1	1
定量限（30 fg/μL）	履歷	11.04％	13.79％	9.55％	14.55％

表7 加速穩定性結果分析

4. 4。參考

4.1 國家藥典委員會（ChPC）。中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，p.542-543，2020年。

4.2國家藥品監督管理局，2007年：《生物製品品質管制分析方法驗證技術審查通則》。

4.3 ICH(2022)《分析方法驗證Q2》，徵求意見稿。

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