分枝桿菌QPCR檢測和方法驗證有助於細胞和基因治療技術開發的發展


近年來，隨著生物醫藥的快速發展，新冠肺炎疫情下細胞和基因治療的興起，以及mRNA疫苗的問世，確保生物製品的安全可靠已成為世界各國政府和監管機構關注的重點。支原體污染是一種常見但通常很難消除的污染類型。監管要求強制要求涉及細胞培養的生物過程「確保不受支原體污染」。

監管機構對支原體檢測的要求：

  • FDA的《產業指南：用於生產傳染病適應症的病毒疫苗的細胞基質和其他生物材料的特性和鑑定》規定了對原料、病毒種子和未加工的收穫液進行支原體控制。
  • 2020年版中國藥典第三部《生物製品生產檢測用動物細胞基質的製備與品質控制》要求對生產細胞，包括主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產終止細胞（EOPC）進行支原體檢測。
  • 《免疫細胞治療產品藥學研究與評估技術指導原則（試行）》建議在關鍵時間點對合適的中間樣品開展支原體安全性相關檢測或實施相關措施控制。支原體檢測也是最終產品的放行檢測之一。

核酸檢測（NAT）與傳統方法：

在核酸擴增技術（NAT）等快速檢測方法出現之前，人們採用的是傳統的培養方法和指示細胞測定法。然而，由於檢測週期較長或敏感性問題，這些方法通常會延長生產或發布週期，或者需要根據風險評估或替代方法的探索有條件地發布細胞材料。隨著細胞和基因治療的進步，業界對時效性、敏感度更高的支原體檢測方法的需求日益增加。由於產品的保質期較短，無法承受較長的測試期，因此 NAT 方法成為了有利的替代方案。

目前，歐洲藥典(EP)<2.6.7>、日本藥典(JP)、美國藥典(USP)<63>均已將NAT方法納入為支原體的檢測方法。然而，對該方法進行驗證並與傳統方法進行比較以確保其靈敏度不低是使用該方法的先決條件。雖然2020年版《中國藥典》尚未將NAT作為支原體的檢測方法，但提到可以使用「國家藥品監督管理部門認可的其他方法」。 2022年5月，國家藥品監督管理局藥品審查中心發布《免疫細胞治療產品藥學研究與評估技術指導原則（試行）》，建議在樣品量有限或需要快速放行、藥典方法不充分的特殊情況下，可考慮開發新的無菌及支原體檢測方法進行放行檢測。因此，預計NAT方法將被更多的原料供應商和先進治療藥物（ATMP）公司採用，作為能夠支援快速支原體釋放檢測的方法。

NAT 方法 - 方法驗證要求

歐洲藥典 <2.6> 詳細描述了 NAT 方法的驗證過程。7>與日本藥典一致，內容基本一致。中國食品藥物檢驗研究院也發表了題為《支原體檢測核酸檢測方法及方法學驗證的考慮》的文章，旨在為我國支原體核酸擴增方法的開發者和使用者提供指導。特異性、檢測極限和穩健性對於驗證支原體 NAT 方法至關重要。如果使用商業試劑盒進行支原體檢測，則可以根據供應商的綜合試劑盒性能報告，結合實驗室環境和樣品類型進行方法適用性驗證。

驗證報告

特異性：

專屬性是指分析方法在存在其他成分（如雜質、降解產物、賦形劑等）的情況下準確測定分析物的能力。此EP強調需要關注與系統發育樹密切相關的其他細菌種類之間的交叉反應，例如革蘭氏陽性菌中的梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌。還應注意常見的污染物類型，例如宿主細胞和實驗環境中的人類 DNA 污染。

檢測極限：

檢測極限是樣品中可檢測到的最低分析物量。它作為定性的識別依據，並不需要量化為一個確切的值。 EP 要求每種支原體在每個稀釋濃度下有 24 個檢測數據點。這可以透過在不同的日子進行三次獨立的 10 倍連續稀釋、對每個稀釋梯度進行八次重複檢測來實現，或者透過在不同的日子進行四次獨立的 10 倍連續稀釋、對每個稀釋梯度進行六次重複檢測來實現。檢測陽性率超過95%可視為檢測極限。對於需要確認檢測極限的支原體型別，試劑盒廠商需依照監管藥典的要求，涵蓋盡可能多的支原體型別，並探討每種支原體的檢測極限。對於生物製藥公司來說，建議也考慮人類支原體類型。

  • 如果在生產過程中使用或遇到禽類細胞或材料，則應進行滑液支原體的檢測極限驗證。
  • 若在生產過程中使用或遇到昆蟲或植物材料，則應進行無膽固醇原體的檢測極限驗證。
  • 豬鼻支原體在支原體污染樣本中盛行率較高，已引起中國食品藥物檢驗研究院的關注。

與歐洲藥典相比，日本藥典並未提到需要進行檢測極限驗證的禽支原體，但包括唾液支原體。

穩健性:

穩健性是指一種方法能夠承受測量條件的細微變化而不受影響的能力，為已建立的方法在常規測試中的使用提供了基礎。穩健性的評估應著重於支原體檢測方法對檢測試劑中MgCl2、引子和dNTP濃度變化、核酸萃取試劑盒或萃取步驟的變化、使用不同核酸擴增子的耐受性。

可比較性研究

如果要以NAT取代藥典方法，則需要透過比較確認NAT可以取代基於培養的方法或指示細胞培養方法。這通常涉及考慮方法的檢測極限以及特異性（例如支原體覆蓋範圍和可能的假陽性）。對於檢測極限的比較，應符合「10 CFU/mL的檢測極限可以取代基於培養的方法，100 CFU/mL的檢測極限可以取代指示細胞培養的方法」的標準。

進行可比性研究有兩種可選方法：

  1. 使用相同的經過驗證的支原體菌株對 NAT 和藥典方法進行同步實驗，以確認檢測極限。
  2. 將 NAT 驗證的結果與先前的藥典方法驗證結果進行比較，但需要仔細記錄兩種方法中使用的支原體標準的確認文件。

NAT 支原體 qPCR 檢測 - 綜合解決方案

相關產品

Yeasen MycAway™ 支原體 qPCR 檢測試劑盒（探針法）是一種基於 NAT（核酸擴增技術）的快速定性檢測產品，用於檢測原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收穫液以及治療細胞中潛在的支原體污染。本試劑盒基於定量PCR技術，利用Taqman螢光探針定性檢測檢測樣本中的支原體DNA，涵蓋160多種支原體DNA序列。嚴格遵循EP 2.6.7和JP G3對支原體檢測的指導原則和要求，具有靈敏度高、特異性好、安全性高等特性。可與MolPure®磁珠殘留DNA樣本預處理試劑盒配合使用，手動萃取樣本，或使用Auto-Pure 32A全自動核酸萃取儀自動萃取核酸。樣本經過預處理去除乾擾雜質，獲得純化的支原體DNA後，透過qPCR採集探針的螢光訊號，判斷檢測結果。

技術服務

  1. 為MycAway™支原體qPCR檢測試劑盒提供全面的驗證報告。
  2. 為客戶樣品適用性驗證提供技術服務。
  3. 提供審計支援。

描述

零件編號

MolPure® 磁性殘留 DNA 檢體製備試劑盒

18461ES
MycAway™ 支原體 qPCR 檢測試劑盒 （2G） 40619ES

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