等溫擴增技術可以在恆定的溫度條件下達到擴增特定核酸序列的目的。由於具有無需特殊設備、擴增時間短、靈敏度高的特點，在現場檢測和即時診斷中展現出良好的應用前景，非常適合分子診斷工具的開發。

在新冠病毒疫情情勢嚴峻、株增多、傳染性增強的背景下，恆溫擴增技術可快速檢測新冠病毒 用簡單的儀器快速檢測，有助於解決傳統PCR技術檢測時間長、對檢測設備和試劑要求高導致部分新冠肺炎患者無法快速確診的問題。 那麼等溫擴增技術之一的RT-LAMP的原理是什麼呢？哪些優質原料 Yeasen 可以提供嗎？

1.RT-LAMP的原理是什麼？
2. RT-LAMP 的引子設計
3. 哪些原料可以 Yeasen 提供？
4. 產品選用指南

1.RT-LAMP的原理是什麼？

2000年，日本學者Notomi等建立了一種新的核酸擴增技術，稱為環介導等溫擴增(LAMP)。 LAMP技術採用針對目的基因的6個區域設計4個特異性引物，在等溫條件下（60～65 ℃）利用鏈置換DNA聚合酶在幾十分鐘內擴增出109個目標序列。經瓊脂糖凝膠電泳判斷結果，陽性結果呈現階梯狀條帶。 LAMP具有特異性強、靈敏度高、操作快速簡單、成本低廉的特性。隨著該技術的不斷改進和完善，目前已應用於多種病原微生物的檢測。

RT-LAMP是在LAMP擴增系統中添加逆轉錄酶的方法，可以實現對病毒RNA的直接檢測。 LAMP擴增效率極高，僅用少量的cDNA就能擴增大量的核酸。節省了核酸擴增過程中逆轉錄的時間，加快了RNA的偵測速度。

DNA在65℃左右處於動態平衡狀態。在鏈置換DNA聚合酶的作用下，從FIP引子的F2段3’端開始，與模板DNA的互補序列配對，引發鏈置換DNA合成。 F3引子與F2c前端的F3c互補，以3’端為起點合成其DNA，同時在鏈置換DNA聚合酶的作用下，取代前導FIP引子合成的DNA鏈。向前延展。最終的 F3 引子合成的 DNA 鏈與一條模板 DNA 鏈形成雙股。 FIP引子合成的DNA鏈被F3引子鏈替換，產生單鏈。此單鏈在5’端具有互補的F1c和F1區段，因此進行自身鹼基配對以形成環狀結構。並且將BIP引子與單鏈雜交結合，並以BIP引子的3’端為起點合成互補鏈，在此過程中結構被打開。再從BIP引子處插入類似F3和B3的引物，進行鹼基互補配對，以3’端為起點合成一條新的互補鏈。置換後的單股DNA兩端均有互補序列，並發生自體鹼基配對，形成環狀結構，因此整條鏈呈現啞鈴狀結構。此結構是RT-LAMP方法擴增循環的起始結構。

在啞鈴型結構中，DNA延伸是以3’端的F1區段為起點，以其自身為模板進行的。而FIP引子F2與環上的單鏈F2c雜交，引發新一輪的鏈置換反應。 F1片段合成的雙股核酸解離，同樣，核酸上形成環狀結構。環狀結構上存在單鏈形式的B2c，BIP引子上的B2與其雜交，啟動新一輪的擴增，經過同樣的過程形成環狀結構。依照這個過程，同一鏈上的互補序列經過配對、鏈延伸，最後形成不同大小的結構。

2. RT-LAMP 的引子設計

引子設計是RT-LAMP成功擴增檢測的關鍵。 RT-LAMP引子包括兩個外引子（F3和B3）和兩個內引子（FIP和BIP）。 F3引子：上游外引物，由F3區組成，與目的基因的F3c區互補。 FIP引子：上游內部引子，由F2區組成，F2區中目的基因3’端的F2c區與目的基因5’端的F1c區互補。 BIP引子：下游內部引子，由B2區組成，B2區與目的基因3’端的B2c區互補，並與目的基因5’端的B1c區具有相同的序列。

與PCR類似，引子設計原則應注意鹼基組成、GC含量、次結構等因素。此外，也應注意以下幾點。內引子FIP和BIP的5’端部分，即F1c和B1c，長度一般為8～50bp。長度優選為15～25bp，且3’末端的Tm值大於F2和B2的Tm值。內側引子FIP和BIP的3’端部分，即F2和B2，長度一般為8～50bp。長度以15-25bp為宜，Tm值與實驗中所選用的Bst DNA聚合酶的最適溫度一致。外引子F3和B3的長度一般為8～50bp。長度優選為15～25bp，其Tm值較F2和B2較小。設計引子時，應考慮環結構和目標序列的大小。當環內鹼基數大於40bp,目標序列大小為130-200bp時,擴增效率最高。

3. 哪些原料可以 Yeasen 提供？

3.1【全新升級】 Yeasen 布施 加 DNA 聚合酶

新升級的 Hieff™ Bst Plus DNA 聚合酶 （貨號：14402ES、14403ES） 是透過表達和純化嗜熱芽孢桿菌的DNA聚合酶基因獲得的 斯普 缺乏大腸桿菌中的 5′→3′ 外切酶結構域。此酶鏈置換能力強，具有靈敏度高、擴增效率高、dUTP耐受性高等優點，可廣泛應用於基於等溫擴增技術的病原體即時檢測。

3.1.1 快速、高靈敏度

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA 聚合酶具有高靈敏度，可檢測低至 5 個拷貝的目標基因。模板量達到飛克（fg）級別，擴增速度比競品更快。

圖 1. RT-LAMP 反應採用 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA 聚合酶（橘色）和競爭對手 N（灰色）和競爭對手 T（藍色）的 Bst 酶可擴增 SARS-CoV-2。結果表明 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase總是能夠比競爭產品更快達到閾值，並且擴增速度更快。

4. 產品選用指南

提供的產品 Yeasen 如下：

表 1.產品資訊