雙塊抗TAQ DNA聚合酶抗體可幫助減少非特異性擴增

分子診斷是IVD領域中發展最快的子領域。具有檢測時間短、靈敏度高、特異性強的優點。廣泛應用於腫瘤伴隨診斷、傳染病、遺傳疾病的篩檢。在分子診斷領域，PCR不僅是最成熟、市佔率最大的技術平台，也是臨床診斷的「黃金標準」技術。傳統的PCR反應中，常會出現非特異性擴增的問題。非特異性擴增直接影響檢測結果的解釋，會導致擴增敏感度的下降，甚至導致目標片段的產量下降。非特異性擴增是如何發生的、如何有效避免？

1. 常規 DNA 聚合酶可導致非特異性擴增

2. 熱啟動聚合酶可提高擴增特異性

3. 雙阻斷Taq抗體可雙倍提高擴增特異性與穩定性

4. 業績展示 Yeasen雙塊 Taq 抗體

5. 產品資訊

1. 常規 DNA 聚合酶可導致非特異性擴增

引子序列特異性差是造成非特異性擴增的直接原因。作為常規DNA聚合酶的啟動子，其外切酶活性可在PCR體系的製備過程中截短DNA引子序列，並降低引子的專一性。

此外，常規的DNA聚合酶不僅具有外切酶活性，還具有聚合酶活性。雖然DNA聚合酶的最適延伸溫度為72℃，但在室溫下聚合酶仍有活性。因此在PCR反應體系的準備以及初始加熱過程中，引子可能與一些單股模板形成非特異性結合並在Taq DNA聚合酶的作用下發生延伸，導致非目標序列的擴增，影響反應的特異性。

因此，PCR系統通常在冰上配置，以抑制DNA聚合酶的活性。此方法雖然簡單、廉價，但無法完全抑制酵素活性，因此無法消除非特異性產物的擴增。

2. 熱啟動聚合酶可提高擴增特異性

熱啟動聚合酶是熱啟動PCR的核心元件。在室溫下，DNA聚合酶的活性位點會被酵素修飾劑阻斷。只有經過PCR經95℃變性後，酵素修飾劑脫落，酵素活性才開始發揮，避免了酵素引起的非特異性擴增。

目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學法、配體法、抗體法。其中抗體修飾的熱啟動聚合酶的阻斷效果最好，且酵素活性釋放速度快，可以大幅減少PCR的反應時間。它是IVD市場廣泛應用的熱啟動酶修飾方法。

但要注意的是，傳統的抗體熱啟動方法只是阻斷了Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性，只能防止低溫下因錯配或引子二聚體引起的非特異性擴增。然而，如上所述，Taq DNA聚合酶不僅具有5'→3'聚合酶活性，而且還具有5'→3'外切酶活性。這種外切酶活性可能導致錯配的探針或其他材料在低溫下降解，從而產生一些非特異性訊號。

3. 雙阻斷Taq抗體可雙倍提高擴增特異性與穩定性

作為國內分子酵素產業的創新領導者， Yeasen 生物技術（上海）有限公司（以下簡稱 Yeasen）專注於分子酵素原料的研發與生產，勇於創新。依托自身成熟的抗體篩選平台，以Taq DNA聚合酶為標靶分子，篩選阻斷抗體。經過多年的潛心研究和系統優化，已經開發出 雙阻斷抗Taq DNA聚合酶抗體，它不僅能夠阻斷Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，而且能夠阻斷Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性。雙管齊下，不僅可以有效防止因錯配或引子二聚體引起的非特異性擴增，還可以防止材料降解產生非特異性訊號，倍增試劑的穩定性。

4. 性能展示 Yeasen雙塊 Taq 抗體

4.1 使用雙阻斷Taq抗體準確、靈敏度更高

阻斷 Taq 聚合酶後 Yeasen雙阻斷抗體 及T公司抗體，陽性樣本採用ARMS-PCR進行檢測。

圖1. ARMS-PCR擴增曲線； 藍色：T公司的阻斷抗體； 紅色的： Yeasen雙阻斷抗體

從圖1可以看出，Taq聚合酶被 Yeasen的雙阻斷抗體在ARMS-PCR擴增中分型準確、靈敏度更高。

4.2 雙阻斷Taq抗體有效 阻斷 Taq DNA 聚合酶的核酸外切酶活性

將合成的引子探針分別與非封閉和雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶反應液匹配,在40℃下反應,檢測它們的螢光訊號。

圖2.雙阻斷抗體對外切酶活性的阻斷效率檢測； 黃色：未封閉的Taq DNA聚合酶組； 紫色：被雙阻斷抗體阻斷的 Taq DNA 聚合酶組

從圖2可以看出 雙阻斷抗體可以有效阻斷Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性。

4.3雙阻斷Taq抗體可有效提升檢測試劑的穩定性

分別以傳統封閉抗體和雙封閉抗體封閉Taq DNA聚合酶並配置成含有引子探針的全預混液。將10000個拷貝的ASF質粒在4℃下擴增10天，或在37℃下擴增1、3和5天。觀察擴增曲線和Ct值的變化,比較傳統阻斷抗體和雙阻斷抗體對全預混反應液穩定性的影響。

圖 3.傳統封閉抗體（a）和雙封閉抗體（b）封閉反應液擴增10000拷貝ASF質粒的擴增曲線； 藍色：4℃保存10天； 紅色：4℃放置0天（對照）

從圖3可以看出雙阻斷抗體比傳統阻斷抗體更能維持反應溶液的穩定性，有效提升檢測試劑的穩定性。含有引子探針的全量預混液經雙阻斷抗體阻斷後,在4℃放置10天,擴增曲線及Ct值無明顯變化。

圖4.傳統封閉抗體（a）和雙封閉抗體（b）封閉反應液擴增10000拷貝ASF質粒的擴增曲線； 藍色：37℃保存5天； 綠色：37℃，持續3天； 黃色：37℃，1天； 紅色：37℃放置0天（對照）

從圖4可以看出雙阻斷抗體比傳統阻斷抗體更能維持反應溶液的穩定性，有效提升檢測試劑的穩定性。雙阻斷抗體對含有引子-探針的整個預混液進行阻斷，在37℃放置1、3、5天后，Ct值差異小於0.2。

4.4 雙阻斷Taq抗體有助於解決基線漂移問題

當某些引子與特定的緩衝液和儀器配合時，會出現基線漂移。 Yeasen 嘗試了多種方法來改善基線問題，發現雙阻斷抗體更有利於基線穩定。

圖5. N基因（a）和ACT基因（b）的擴增曲線； 紅色：傳統阻斷抗體； 綠色：雙阻斷抗體

從圖5可以看出，在特定的引子和緩衝液下使用雙阻斷抗體有助於解決基線漂移的問題。

4.5 使用雙阻斷 Taq 抗體以獲得良好的線性

以雙封閉抗體封閉的反應液分別擴增100000、10000、1000、1000、100個拷貝的ASF/ACT雙質粒，製作標準曲線。

圖6 雙阻斷反應液製備ASF基因（a）及ACT基因（b）標準曲線

從圖6可以看出，標準曲線R2 ASF基因的PCR擴增效率為0.998,擴增效率為98.848%；標準曲線 R2 ACT基因的PCR擴增產物陽性率為0.998,擴增效率為98.113%。

4.6 雙阻斷 Taq 抗體可以快速釋放酵素活性

用進口T公司抗體封閉Taq聚合酶， Yeasen的雙阻斷抗體（cat#31303） ,95℃熱激20s後檢測酵素活力。可看出31303在95℃，20s熱休克後仍能釋放95%以上的酵素活，與T公司抗體相當。

表 1. 酵素活性

4.7 雙阻斷 Taq 抗體 可以阻斷多種類型的 Taq 酶

三種 Taq 酵素（野生型和 2 種突變型）被阻斷 Yeasen的雙阻斷抗體(cat#31303)，阻斷比例為1μg:5U，測定螢光值及封堵效率。可以看出， Yeasen的雙阻斷抗體（cat#31303）較適合不同類型的Taq酶。

表2. 不同類型Taq酶的阻斷效率

4.8 Yeasen的 雙阻斷 Taq 抗體在小鼠體內沒有基因組殘留

以水為陰性對照模板、以小鼠基因組為陽性對照模板，擴增了31,303個不同批次。結果發現，樣本中未擴增出目的片段，顯示抗體中不存在小鼠基因組殘留。

圖7. 小鼠基因組殘留檢測圖

註：-為陰性對照，+為陽性對照，1-5為不同批次的31303個樣品

5. 產品資訊