自2022年3月狡猾的奧密克戎變異株再次打破人們平靜的生活以來，新型冠狀病毒疫情在全國範圍內爆發，波及30個省（區、市）。作為精準防治新冠病毒疫情的有效手段，核酸檢測已成為人們常態化的生活方式。 “你今天做核酸檢測了嗎？”這也成為了人們日常的問候語。說到這裡，你知道核酸檢測需要哪些核心原料嗎？本文就來介紹核酸檢測酶中關鍵的核心原料。

1. SARS-CoV-2 核酸檢測流程

2. 核酸萃取的核心酶

3. RT-qPCR 過程中的核心酶

4. 新冠病毒核酸檢測核心酶 Yeasen

1. SARS-CoV-2核酸檢測流程

酵素是一類極為重要的生物催化劑，具有較高的催化效率和反應特異性。大多數生化反應都需要酵素的參與。在2019-nCoV核酸檢測過程中（如圖1所示），不同類型的分子酵素在核酸萃取、RT-qPCR等不同實驗階段中扮演重要角色。接下來，根據核酸檢測中實驗環節的不同，我們將對核酸檢測過程中所使用的核心酵素原料進行整理。

圖1. SARS-CoV-2核酸檢測流程

2. 核酸萃取的核心酶

新冠病毒核酸萃取過程主要包括裂解和純化兩個步驟。裂解是破壞樣本的細胞結構，使樣本中的核酸遊離於裂解體系中的過程；純化是將核酸與裂解體系中的其他成分，如蛋白質、鹽類和其他雜質完全分離，反應過程需要蛋白酶K、脫氧核糖核酸酶I和RNase抑制劑的參與。

2.1 蛋白酶K

蛋白酶K是一種具有廣泛切割活性的絲胺酸蛋白酶，切割位點是脂肪族和芳香族胺基酸的羧基末端勝肽鍵（圖2）。在核酸萃取過程中，蛋白酶K可以降解與核酸緊密結合的組蛋白，促進核酸的分離，使樣本核酸更容易萃取。此外，蛋白酶K可以降低RNA水解酶（RNase）活性並抑制RNase對模板RNA的水解。

圖2.蛋白酶K水解勝肽鍵示意圖

Yeasen 生物技術 蛋白酶K (Cat#10401ES)來自重組酵母菌株，比活≥30 U/mg，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶穩定。其活性pH範圍較寬（pH 4.0~12.0），適用於原位雜交樣品製備、核酸純化等蛋白質的裂解與去除。

2.2 去氧核糖核酸酶I

脫氧核糖核酸酶I（DNase I）可催化多種形式的DNA，標靶切割嘧啶相鄰的磷酸二酯鍵，產生5'端帶有磷酸基、3'端帶有羥基的多核苷酸，平均消化產物為最小的多四核苷酸。在SARS-CoV-2核酸萃取過程中，DNase I主要用於去除RNA樣本中的基因組污染，避免RNA模板中DNA殘留，並提高模板的純度。

Yeasen 生物技術 脫氧核糖核酸酶 (Cat#10325ES)來自重組大腸桿菌菌株，不含RNase，可用於處理各種RNA樣本。最佳工作pH值範圍為7.0～8.0。在Mg2+存在下，DNase I可以隨機切割雙股DNA的任意位點；在 Mn 存在下²⁺其中，DNase I可以在同一位點切割雙股DNA，形成平末端或1-2個核苷酸懸垂的黏性末端（如圖3所示）。

圖3. DNase I 在Mg存在下切割dsDNA的示意圖²⁺ 和錳²⁺

2.3 RNase抑制劑

在SARS-CoV-2核酸檢測過程中，樣本核酸的萃取、純化或實驗反應體系的製備可能會引入核糖核酸酶（RNase）污染，導致RNA模板的降解。為了避免 RNase 污染，需要使用 RNase 抑制劑。

RNase Inhibitor是人類胎盤中的特異性RNase抑制劑，能夠特異性地與RNase結合，形成以非共價鍵形成的複合物，使RNase失去活性。 Yeasen 生物技術 小鼠 RNase 抑制劑 (Cat#10603ES) 不含有人類蛋白質中對氧化非常敏感的兩種半胱氨酸。具有較高的抗氧化活性，能廣泛抑制各類RNases（RNase A、B、C），較適合qPCR等對高二硫蘇糖醇（DTT）敏感的實驗。

3. RT-qPCR 過程中的核心酶

SARS-CoV-2樣本核酸萃取完成後，即可透過RT-qPCR完成核酸檢測。在這些實驗過程中，DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等都是不可或缺的核心酵素原料。

3.1 逆轉錄酶

SARS-CoV-2 RNA在萃取純化後，需要逆轉錄酶催化dNTP聚合，產生與模板RNA互補的cDNA序列（圖4）。對於RT-qPCR反應，應選擇耐高溫的逆轉錄酶。目前應用最廣泛的是MMLV逆轉錄酶，由於其缺乏DNA內切酶活性和較低的RNase H活性，在cDNA克隆應用方面更顯優勢。

圖4.逆轉錄過程示意圖

Yeasen 生物技術 希菲爾™ V 逆轉錄酶 (Cat#11300ES)是透過基因工程技術獲得的新型逆轉錄酶。它具有良好的熱穩定性，可承受高達60°C的反應溫度。而且它也是 適用於具有複雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。同時此酵素與模板的親和力增強，適合少量模板及低拷貝基因的逆轉錄，可擴增達10kb的cDNA。

3.2 DNA聚合酶

模板逆轉錄過程完成產生雙股cDNA後，需要PCR反應中的「靈魂選手」DNA聚合酶登場，透過聚合遊離的脫氧核糖核苷酸來延長DNA鏈，在體外對大量模板DNA進行擴增，達到病毒核酸檢測的目的。

RT-qPCR 反應中常用的 DNA 聚合酶是熱啟動 Taq DNA 聚合酶。這種酵素在室溫下不活躍。它只有在熱啟動後才具有聚合活性，可以最大限度地減少背景訊號的產生。解決了常規PCR反應中因引子二聚體的產生或錯配而引起的非特異性擴增的問題。目前常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學修飾、配體修飾及抗體修飾。不同熱啟動改造方法的原理如圖5所示。

圖5. 不同類型的修飾熱啟動酶示意圖

Yeasen 生物技術 UNICONTM Hotstart 高特異性 Taq DNA 聚合酶，5 U/μL（Cat#10726ES）是一種具有高模板親和力的雙重阻斷熱啟動 DNA 聚合酶。在室溫下，不僅 5'→3' 聚合酶活性被阻斷，但 5'→3' 外切酶活性被阻斷。 95°C 變性 30 秒可完全滅活阻斷抗體，釋放 DNA 聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙重阻斷特性不僅可以有效防止由於錯配或引子二聚體引起的非特異性擴增，還可以有效抑制探針降解引起的螢光訊號的下降。雙重保障使得體外檢測試劑在運輸或常溫使用過程中更穩定。

3.3 尿嘧啶DNA糖基化酶

在新冠病毒核酸檢測過程中，操作環境中的氣溶膠污染是造成PCR結果為假陽性最常見的因素。在擴增系統中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）可以有效消除混入PCR體系中的擴增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），確保擴增結果的準確性。 UDG酶的抗污染原理如圖6所示。

圖6. UDG酶抗污染原理示意圖

Yeasen 生物技術 尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG/UNG)，不耐熱，1 U/μL (Cat#10303ES) 在 25-37°C 時活躍，對熱敏感，在 50°C 下 10 分鐘或在 95°C 下 2 分鐘時不可逆失活。不含內切酶和RNase殘留，宿主菌基因組殘留量小於10拷貝。可與熱啟動Taq DNA聚合酶搭配使用，確保擴增反應的特異性。

4.SARS-CoV-2 核酸檢測核心酶 Yeasen

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