PCR（聚合酶鍊式反應）是分子生物學的一項基石技術，廣泛用於基因克隆、診斷測試和研究。雖然它快速、有效率且高度具體，但即使是經驗豐富的研究人員有時也會遇到可能影響實驗結果的細微陷阱。為了幫助您排除故障並優化 PCR 實驗，我們整理了此免費指南，其中包含 5 個您可能未考慮過的重要提示。透過微調這些小細節，您將看到更好的結果、更高的產量和更少的非特異性擴增。
PCR原理
了解 PCR：基礎知識
PCR 的核心 透過重複一系列溫度驅動的步驟來擴增特定的 DNA 片段： 變性、退火和延伸。透過這些循環，DNA聚合酶合成新的DNA鏈，每個循環都會使DNA的數量加倍。經過足夠次數的循環後，您的目標 DNA 片段便可被偵測到。
PCR 產量通常遵循指數成長曲線，DNA 在每個循環中翻倍，直到達到穩定期。標準PCR公式為：
PCR 產物產量 = 2^N 拷貝 （其中 N 是循環次數）。
然而，隨著循環次數的增加，Taq 聚合酶、dNTP 和引子等試劑 被消耗，且副產品會積累，導致停滯。
PCR擴增曲線
理解和優化該曲線是獲得高品質 PCR 結果的關鍵。
1.調整 您的 PCR 循環條件
優化 PCR 最關鍵的步驟之一是調整循環參數。
陷阱 1：循環次數太少
如果您沒有運行足夠的循環，特別是在模板濃度較低的情況下，您的目標 DNA 可能無法充分擴增。通常，建議進行 30-40 個循環以實現強大的擴增。如果您的模板很稀疏，請不要害怕追求該範圍的高端。
陷阱 2：循環次數過多
雖然增加循環次數來提高產量似乎很誘人，但過度循環可能會導致非特異性擴增和假陽性。此反應通常在 25-35 個循環後達到最大產量，之後進入平台期，產物產量不會顯著增加。
提示：為了避免這種情況，請使用高性能 PCR 試劑，如 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 預混液 （Cat# 10167ES），可減少反應停滯並在僅 30-35 個循環內實現高產量。
圖 1：10167 擴增了 576 bp 大腸桿菌菌落，其基因來自擬南芥，其表現優於競爭產物。延伸時間為30秒/kb，擴增34個循環。
2.完善你的引子設計
引子設計是任何 PCR 實驗的基礎，這裡的小錯誤可能會破壞整個反應。
陷阱 1：忽略 3' 端構圖
雖然許多研究人員關注 GC 含量和引子長度，但引子的 3' 端是一個至關重要的考慮因素。理想情況下，最後幾個鹼基應該是 G 或 C，以增加引子-模板結合穩定性並減少錯誤引導或錯配。
陷阱2：引子濃度不正確
如果引子濃度過高，則可能會增加引子二聚體或非特異性結合的可能性。相反，如果太低，可能無法獲得足夠的放大。最佳最終引子濃度通常在0.4至0.5μM之間。
提示：正向和反向引子的濃度應保持在 0.4-0.5 μM 左右，這是 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 預混液 成套工具。一致性可確保更少的錯誤和更可靠的結果。
| 成分 | 容量 (μL) | 容量 (μL) | 最終濃度 |
| 2×希夫® 超快速 II 熱啟動 PCR 預混液* | 二十五 | 12.5 | 1× |
| 模板** | 十 | 十 | - |
| 正向引子 F（10 μM）*** | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
| 反向引子 R （10 μM） | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
| 氫鍵2哦 | 最多 50 | 最多 25 | - |
3. 注意模板 DNA 的品質和數量
模板 DNA 在 PCR 反應中起著關鍵作用，品質或濃度問題可能會導致擴增不良。
陷阱1：模板DNA降解
DNA 會隨著時間的推移而降解，尤其是在儲存不當的情況下。確保定期測試模板的濃度，特別是在模板存放了較長時間的情況下。在開始實驗之前務必重新量化 DNA，以確保結果準確。
陷阱2：不正確的模板處理技術
對於某些生物（例如酵母）來說，模板製備可能會改變整個模式。例如，使用酵母時，將細胞煮沸 5 分鐘，然後在 -80°C 下冷凍 3 分鐘，然後解凍，可以顯著提高 PCR 產量。
10167ES 酵母擴增
提示：始終使用新鮮製備且定量良好的模板 DNA。如果您正在使用更困難的模板（如酵母），請考慮優化萃取協議以獲得更好的結果。
4. 避免試劑受到污染
試劑污染常常是導致 PCR 失敗的一個被忽略的原因。這包括移液器的物理污染和試劑之間的交叉污染。
陷阱1：試劑交叉污染
引子等 PCR 試劑經常會經歷多次凍融循環，這會增加污染的風險。始終將引子作為反應的最後組成部分之一添加，以盡量減少這種風險至關重要。
陷阱2：非特異性擴增
如果引子沒有按照正確的順序添加，或者每個步驟之間沒有更換移液器吸頭，則可能會發生反應之間的交叉污染，從而導致非特異性擴增。
提示：依照最佳順序加入試劑：水→引子→模板→PCR Mix酶。這有助於避免污染問題並使您的反應保持清潔和可靠。
5. 選擇正確的 PCR 混合物和添加劑
並非所有 PCR 混合物都是一樣的，選擇正確的 PCR 混合物會對實驗的成功產生重大影響。
陷阱 1：使用劣質 PCR 混合物
有些 PCR 混合物在處理複雜模板或高 GC 含量時效率較低。對於具有挑戰性的反應，請考慮使用專為快速有效擴增而設計的高性能混合物。
提示：我們建議使用 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 主混合物（目錄號 10167ES），它提供了更快的延伸時間和更好的複雜模板性能。其處理高 GC 含量和大片段的能力無與倫比，可在更短的時間內為您提供更高的產量。
性能演示
- 快速有效的菌落擴增
圖 1：大腸桿菌菌落的極限延伸時間擴增試驗。 對於3kb以內的片段，10167ES的延伸效率可達1秒/kb其中，對於6kb片段的延伸效率為3sec/kb，而對於6-10kb片段，效率可達5sec/kb。 M：10,000 DNA 標記（10505ES）。
- 長片段、高GC菌液的快速高效擴增
圖 2： 長片段和高 GC 菌液擴增顯示 10167ES 產量更高，檢測率達 100%，優於競爭產品。 M：10,000 DNA 標記（10505ES）。 10167ES的延伸速度為10秒/kb，而競爭產品則為15秒/kb。
結論：細節決定成敗
優化 PCR 不僅僅是一步一步地遵循協議，還包括了解如何透過微小的變化來顯著改善結果。從微調循環條件到確保試劑質量，注意這些細節可以成就或破壞您的 PCR 實驗。
透過花時間優化您的方案並使用正確的試劑，例如 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 預混液，可以顯著提高您的 PCR 效率和產量。請記住，在 PCR 領域，魔鬼就在細節中。
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關於 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
這種新一代 PCR 混合物專為快速、高效和高產量擴增而設計。無論您處理的是細菌菌落、困難的模板還是高 GC 含量，這種混合物都可以幫助您以更短的時間和更少的循環獲得最佳結果。
Fast PCR Master Mix升級版
2×希夫® 超快速 II 熱啟動 PCR 預混液
快速、有效率、消除停滯、提高產量
| 產品定位 | 姓名 | 目錄編號 | 規格 |
| 升級快速PCR，適用於細菌PCR和複雜模板擴增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 預混液 | 1毫升/5×1毫升 | |
| 最快5分鐘一步克隆1-7個片段。 | Hieff Clone® Universal II 一步式克隆試劑盒 | 20噸/50噸 |
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