第 1 章:PCR 技術
1.1 PCR 原理
PCR(聚合酶鍊式反應)即聚合酶鍊式反應,是指 DNA 聚合酶 以DNA母鏈為模板, 特異性引子 為了延長起點,加入 dNTP、Mg2+ 和 延伸因子,擴增增強 因素。 透過變性、退火和延伸步驟, 子鏈在體外複製時與母鏈模板DNA互補,能在體外快速、特異地擴增任何目標DNA。
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1.2 DNA 聚合酶的分類
DNA pol 是一種 重要的酶 蜂巢 DNA 複製。根據熱穩定性、合成能力、速度、保真度和 特異性,可分為Taq DNA聚合酶,高保真DNA聚合酶,熱啟動DNA聚合酶,直接擴增DNA聚合酶,長片段化DNA聚合酶 酵素、快速DNA聚合酶、多重DNA聚合酶等。
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其中最常見的是 Taq DNA 聚合酶,它在 5'→3' 端具有聚合酶活性,並且 外切酶活性 5'→3' 端,但沒有 3'→5'端校正活性。 Taq最重要的特性是其良好的耐熱性,能夠耐受熱變性 步 PCR 的,因此不需要在中途添加更多的酵素。 然而,Taq 的保真度較低,因為它沒有校對活動。保真度 主要透過鎂離子與dNTP的濃度和比例來實現。
高保真DNA聚合酶含有一個聚合中心和一個切割中心,聚合中心具有5'→3'DNA聚合酶活性,可催化 DNA 的合成 沿5'→3'方向;酶切中心具有3'→5'外切酶活性,可進行鹼基錯配的修復。因此,高保真DNA聚合酶除了具有Taq DNA聚合酶的特性外,還具有校正活性,負責 切除 不匹配 核苷酸,從而保證了產品的準確性。
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上圖顯示了 DNA 聚合酶的工作原理 [1]。
直接 PCR(Direct PCR)是一種 反應 使用未純化的樣本進行 PCR 擴增和動物 或植物組織直接擴增。現在,
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上圖顯示了直接 PCR 技術。
一個。 直接法:取少量樣本直接加入PCR PCR 鑑定用 Master Mix;
B. 裂解方法: 樣本取完後加入裂解液釋放基因組,取少量裂解上清加入PCR Master Mix進行PCR鑑定。
1.3 常見問題及解決方法
麻煩 | 原因 | 解決方案 |
無放大帶 | 電泳系統問題 | 解決核酸染料、凝膠濃度和電泳緩衝液的問題。 |
變性溫度不準確 | PCR儀指示的溫度和實際溫度一致嗎?如果溫度過高,酵素會迅速 在最初幾個週期中;如果太低,模板變性不完全。 | |
反應體系中蛋白酶、核酸酶污染 | 加入Taq酶前,反應體系應先加熱至95°C,持續5-10分鐘。 | |
磷韻律錯誤 | 使用 BLAST 檢查引子特異性或重新設計引子。 | |
模板含有雜質 | 特別是甲醛固定、石蠟包埋的組織中常含有甲酸,導致DNA脫嘌呤,影響PCR結果。 | |
底漆劣化和失效 | 確認合成引子正確、純化或因不適當的儲存條件而失去活性。 | |
PCR 產物量較少 | 退火溫度不合適 | 設計梯度PCR反應,優化退火溫度,梯度為2度。 |
DNA 模板中存在抑制劑 | 確保 DNA 模板是乾淨的。 | |
長時間變性 | 長時間變性會導致 DNA 聚合酶失去活性。 | |
延伸太短 | 延長時間太短。以1kb/min為原則設定延伸時間。 | |
DNA 模板量太低 | 增加 DNA 模板的數量。 | |
引子數量不足 | 增加系統中的引子含量。 | |
PCR 循環次數不足 | 增加反應循環次數。 | |
多頻段 | 引子特異性差 | 利用BLAST、Primer等引子設計軟體檢查引子特異性或重新設計引子。 |
循環次數過多 | 適當增加模板用量,減少循環次數。 | |
外源性 DNA 污染 | 確保清潔操作。 | |
模板數量太多 | 質粒DNA的量應<50ng,基因組DNA的量應<200ng。 | |
底漆過多 | 減少反應體系中的引子量。 | |
反應溶液混合不充分 | 確保反應緩衝液完全融化並充分混合。 | |
鎂 高濃度 | 適當調整所用Mg的濃度。 | |
酵素用量過高或酵素質量差 | 減少酵素的量或用其他來源代替。 | |
退火溫度低,退火及延伸時間長 | 提高退火溫度,減少變性和延伸時間,或設計梯度PCR反應,優化退火溫度。 | |
PCR 混合物本身的問題 | 如果是PCR premix,則可能是試劑本身品質問題,建議換批次或其他品牌。 | |
尺寸不對 | 碳污染 | 使用新的試劑和槍頭清潔工作台。 |
模板或引子使用不當 | 更換引子和模板。 | |
格基因型 | 對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。 |
第 2 章:核酸電泳
2.1 核酸電泳原理
帶電粒子在電場作用下,朝與其電性質相反的電極方向移動的現象稱為電泳。利用電場中的帶電粒子 以不同的速度移動而實現分離的技術稱為電泳。核酸電泳是一種 重要工具 用於核酸研究 並且是 技術的組成部分,例如 核酸探針、核酸擴增 和序列分析。核酸電泳通常 執行 在瓊脂糖或 聚丙烯醯胺凝膠。不同濃度的 瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以形成不同分子篩網孔大小的凝膠,可用來分離不同分子量的核酸片段。
2.2 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖是從海藻中提取的線性聚合物。將瓊脂糖放入緩衝溶液中加熱,融化成清澈透明的溶膠,然後倒入 放入明膠模具中凝固形成固體基質,稱為凝膠,其密度取決於 瓊脂糖的濃度。
瓊脂糖 凝膠電泳是一種以瓊脂糖為支撐介質的電泳方法, 主要的區別在於 分析 原理和其他支持電泳的是它具有 雙重角色 “分子篩”和“電泳”。這 凝膠被放置在 電場, 在下面 的行動 電場,帶電 核酸遷移到 積極的 極 透過 網格 的 這 凝膠。 這 率 遷移受到 核酸分子、瓊脂糖濃度、 施加的電壓、電場、電泳緩衝液和嵌入染料的量。 經過適當的電泳時間s是 在下面 不同條件,不同大小、構象的核酸片段會位於凝膠上的不同位置,以達到分離的目的。瓊脂糖凝膠分離 用途廣泛,常用於DNA切割凝膠回收、DNA分離、用於支持DNA是否重組, 質粒等。 可以與長度分開 200基點 到 50kb 的 脫氧核糖核酸 碎片。
2.3 實驗方法
製作 膠水
以1%濃度為例:秤取1g瓊脂糖,倒入250ml錐形瓶中,加入100ml 0.5×TBE電泳緩衝液 攪拌均勻,放入微波爐煮熟,然後 自然乾燥至60℃左右,加入適量核酸染料搖勻,倒入已配好的乾淨凝膠板中,雙手拿梳子 垂直插入凝膠溶液中,等待 凝膠 自然冷卻至完全凝固(25-30分鐘)。
取下膠水製作梳
小心地將凝膠轉移到電泳槽中(使用凝膠托盤或僅使用凝膠), 將樣品孔側置於負極,加入0.5×TBE 電泳緩衝液至凝膠低於約1毫米。
添加 樣本
加入10×上樣緩衝液(上樣 緩衝) DNA 樣本, 混合均勻,然後緩慢地將樣品混合物加入到b合併凝膠 井 用移液槍,每孔加入5-10 μL樣本(不超過40 μL)。一般來說,第一個孔應該裝有 DNA marker,第二個孔裝有陽性對照(定義的 DNA), 和 第三個為陰性對照(試劑或水), 和 應記錄樣品的順序。
電泳
蓋上 電泳槽,連接 電線、接通電源,設定電泳電壓、電流 和時間 參數。一般來說, 電壓不應超過5伏特/公分(長度指 電泳槽正負極距離), 和 電泳時間一般為 15-30分鐘。
電泳結束
消除 這 凝膠(不含凝膠托盤)並在紫外線成像系統下成像,以獲得清晰的電泳圖像,然後對電泳圖像進行編輯 使用影像編輯軟體和 標籤上應標明樣品資訊、日期及操作員。
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2.4 常見問題及解決方法
麻煩 | 原因 | 解決方案 |
缺少目標帶 | 小 DNA 從凝膠流出 | 縮短電泳時間,降低電壓,增加凝膠濃度。 |
分子量大小相似的 DNA 帶不易區分 | 增加電泳時間以配合最佳凝膠濃度。 | |
目標片段對於常規電泳來說太大。 | 以脈衝凝膠電泳進行分析。 | |
無目的剪輯 | PCR過程故障,沒有擴增出目標產物。 | |
DNA 帶模糊 | 過期的電泳緩衝液 | 電泳緩衝液多次使用後,會出現離子強度降低,PH值上升緩慢,沖洗能力減弱,進而影響電泳效果,所以建議經常更換電泳緩衝液。 |
DNA降解 | 避免核酸酶污染。 | |
所使用的電泳條件不適合電泳 | 電泳電壓不超過20V/cm,溫度<30℃;大鏈DNA電泳溫度應<15℃;檢查所使用的電泳緩衝液是否有足夠的緩衝能力。 | |
過度的 DNA 採樣 | 減少凝膠中上採樣的 DNA 量。 | |
DNA 樣本太鹹 | 電泳前用乙醇沉澱去除多餘的鹽。 | |
蛋白質污染 | 電泳前用苯酚萃取去除蛋白質。 | |
樣品濃度過高 | 上樣濃度應小於500ng/孔,濃度過高會影響電泳速度、跑樣速度,造成拖沓、模糊。 | |
弱帶或無帶 | DNA 樣本數不足 | 增加 DNA 攝取量 |
DNA降解 | 避免 DNA 受到核酸酶污染 | |
核酸染料的光源不合適 | 根據核酸染料的說明書選擇適當波長的光源。 | |
帶狀未分離 | 缺乏時間 | 增加電泳時間 |
凝膠濃度不正確 | 膠水濃度過高,導致分離阻力太大。 | |
樣品中鹽離子濃度過高 | 高濃度的鹽離子會增加電泳電阻並阻止帶分離,例如含有核酸內切酶緩衝液的消化樣本。 | |
非特異性條帶 | RNA污染 | 重新製備樣品 |
樣品間的污染 | 填充過程中更換尖端;避免體積 >40 μl 的樣品溢出。 |
2.5 聚丙烯醯胺凝膠電泳
聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺單體、鍊式聚合催化劑N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨、交聯劑N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺經化學反應而成。丙烯醯胺單體在催化劑作用下聚合形成長 鏈,即 交聯 經過 交聯劑形成凝膠,凝膠的孔徑由鍊長和交聯程度決定。孔徑由鍊長和 交聯度。 鍊長取決於 丙烯醯胺的濃度,透過調節丙烯醯胺與交聯劑的比例可以改變聚合物的交聯度。
聚丙烯醯胺凝膠電泳可用於 分離 樣本基於 差異 收費, 分子大小和形狀 電泳樣品。它結合了分子篩和靜電 ,其分辨能力比瓊脂糖凝膠電泳高。 DNA 片段 僅相差 一個核苷酸 可以分開。
聚丙烯醯胺凝膠電泳用於分析和製備長度小於 1 kb 的 DNA 片段。根據 的大小 需要分離的核酸片段, 凝膠 不同的 可以準備。
不同濃度丙烯醯胺與DNA的有效分離範圍如下表所示:
濃度。 (%) | 有效分離範圍 (bp) |
3.5 | 100 至 2000 |
5 | 80 至 500 |
8 | 60 至 400 |
12 | 40 至 200 |
15 | 25 至 150 |
20 | 10 至 100 |
2.4 相關產品選擇指南
常規 PCR | ||||
規格 | 10167ES | 10102ES | 10103ES | 10108ES |
擴增增長度 | ≤10-15 千位元組 | ≤5kb | ≤5kb | ≤4kb |
延長時間 | 1-10 秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb |
產品最終結構 | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA |
退火溫度 | 60℃ | 溫度-(2~5)℃ | 溫度-(2~5)℃ | 溫度-(2~5)℃ |
GC 相容範圍 | 30-70% | 40-70% | 40-70% | 30-70% |
5'-3' 核酸外切酶活性 | 展示 | 展示 | 展示 | 展示 |
菌落 PCR | 合適的 | 合適的 | 合適的 | 合適的 |
基因鑑定 | 合適的 | 合適的 | 合適的 | 合適的 |
多重PCR | 不宜 | 不宜 | 不宜 | 3-4 重 PCR |
電泳指示劑 | 紫紅色 | 藍色的 | 無色 | 藍色的 |
熱啟動 | 熱啟動 | 非熱啟動 | 非熱啟動 | 熱啟動 |
預混料/套件 | 預混料 | 預混料 | 預混料 | 預混料 |
直接 PCR | ||||
規格 | 10185ES | 10188ES | 10187ES | |
產品類型 | 小鼠直接擴增 | 血液直接擴增 | 植物直接擴增 | |
擴增增長度 | ≤1kb | ≤8kb | ≤1kb | |
延長時間 | 30秒/千字節 | ≤2 kb 時為 3-5 s/kb, | 60秒/千字節 | |
≤8 kb 時為 10 s/kb | ||||
樣品裂解時間 | 15 分鐘 | 0-3分鐘 | 0-10 分鐘 | |
產品最終結構 | 鈍端 | 鈍端 | 鈍端 | |
退火溫度 | 鉈-(2~5)℃ | 鉈-(1~2)℃ | 鉈-(2~5)℃ | |
GC 相容範圍 | 30-70% | 30-75% | 40-65% | |
5'-3' 核酸外切酶活性 | √ | √ | √ | |
基因鑑定 | √ | √ | √ | |
多重PCR | 3-4 叢 | |||
直接樣本擴增 | √ | √ | √ | |
電泳指示劑 | 藍色的 | 無色 | 藍色的 | |
熱啟動 | √ | √ | √ | |
預混料/套件 | 套件(含混合料) | 套件(含混合液 + 緩衝液) | 套件(含混合料) | |
適用生物 | 小鼠, 大鼠 | 人、小鼠、山羊、雞、豬等。 | 米、玉米、煙草、油菜籽、小麥、大豆等。 | |
適用組織/材料 | 尾巴、耳朵、腳趾(有肌肉)和其他器官 | 含有 EDTA、肝素、檸檬酸鹽等的新鮮血液、冷藏(冷凍)血液、商用乾血斑 | 幼葉、老葉、幼苗、幼莖 | |
範例輸入 | 組織:5-10毫克;尾:1-5毫米 | 全血:0.5%-20%, 乾血斑:1 mm² | 葉:1-10毫米,種子:1-3毫米 | |
高保真 PCR | ||||
規格 | 10164ES | 10153ES | 10154ES | |
擴增增長度 | ≤10 kb gDNA,≤10 kb cDNA,≤16 kb λDNA | ≤10 kb gDNA,≤10 kb cDNA,≤13 kb λDNA | ≤10 kb gDNA,≤10 kb cDNA,≤13 kb λDNA | |
延長時間 | 5秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb | |
保真度 (Taq) | 83× | 83× | 83× | |
產品最終結構 | 鈍端 | 鈍端 | 鈍端 | |
退火溫度 | 60℃ | 68℃ | 68℃ | |
GC 相容範圍 | 20-80% | 30-60% | 30-60% | |
5'-3' 核酸外切酶活性 | 缺席的 | 缺席的 | 缺席的 | |
電泳指示劑 | 藍色的 | 無色 | 藍色的 | |
單酵素/預混料 | 預混料 | 單酵素 | 預混料 | |
寬容 | / | / | 血液、小鼠組織裂解物 | |
核酸電泳 | ||||
產品類別 | 貨號 | 產品名稱 | 應用 | |
瓊脂糖 | 10208ES | 瓊脂糖 | 常規核酸電泳 | |
10221ES | 高篩瓊脂糖(PCR 級) | 適用於分離20 bp-800 bp的DNA片段,可與聚丙烯醯胺凝膠媲美 | ||
10226ES | 瓊脂糖片 (0.5克/片) | 方便常規瓊脂糖應用 | ||
核酸染料 | 10202ES | YeaRed 核酸凝膠染色劑(水中 10,000 倍) | 水溶性,光譜特性與 EB 相似,可在 300 nm 紫外光下激發 | |
DNA 標記 | 10510ES | GoldBand 1 kb DNA 梯狀圖 | 250-12000 bp(13 條帶) | |
10515ES | GoldBand 50 bp DNA 梯子 | 50-1000 bp(14 條帶) | ||
10507ES | GoldBand 100bp DNA 梯狀圖 | 100-1500 bp(12 條帶) | ||
10516ES | GoldBand 100 bp 加 DNA 梯子 | 100-3000 bp(14 條帶) | ||
10517ES | GoldBand 200 bp DNA 梯子 | 200-5000 bp(12 條帶) | ||
10518ES | GoldBand 500 bp DNA 梯子 | 500-5000 bp(8 條帶) | ||
10501ES | GoldBand DL2000 DNA 標記 | 100-2000 bp(6 條帶) | ||
10504ES | GoldBand DL5000 DNA 標記 | 100-5000 bp(9 條帶) | ||
10505ES | GoldBand DL10,000 DNA 標記 | 100-10000 bp(10 條帶) | ||
10511ES | GoldBand 全尺寸 DNA 梯狀圖 | 100-12000 bp(20 條帶) | ||
10512ES | GoldBand DL15000 DNA 標記 | 250-15000 bp(7 條帶) |
2.5 使用核酸電泳產品的出版品(P人工的)
[1] 羅建, 楊 Q,張X,等。 TFPI 是高毒性進化枝 2 C. difficile 的 TcdB 結腸隱窩受體。 細胞。 2022;185(6):980-994。 e15。 doi:10.1016/j.cell.2022.02.010(影響因子:41.584)
[2] 黃娜, 陳暉, 龔華, 等. SeHed,一種利用壓力誘發過氧化氫的新型基因表現系統 消除酸鹼性能和抗衰老作用。訊號傳導和標靶治療。 2022,7,235。 10.1038/s41392-022-01047-2。 (影響因子:38.1)
[3] 張聰,周斌,顧鋒,等.微肽PACMP抑制引起合成致死效應 透過降低 CtIP 和聚(ADP-核糖基化)。 mol細胞。 2022;82(7):1297-1312.e8。 doi:10.1016/j.molcel.2022.01.020 (影響因子:17.970)
[4] 朱梅, 戴欣.改變 (p)ppGpp 水平導致生長抑制,這是由於非最優 資源配置 大腸桿菌。核酸研究。 2019;47(9):4684-4693。 doi:10。1093/nar/gkz211(影響因子:11.147)
[5] Rizwan HM,Zhimin L, HarsonowatiW 等人。鑑定真菌病原體以控制採後 百香果 (Passiflora edulis) 的腐爛和多組學比較通路分析揭示 紫色更具抵抗力 對病原體的抵抗力比黃色品種高。 j 真菌(巴塞爾)。 2021;7(10):879。已發布 2021 年 10 月 19 日。 7100879 (影響因子:5.816)
[6] 李婷, 週斌, 羅哲, 等.結構表徵 具有廣泛活性的中和奈米抗體 SARS-CoV-2 變體。前沿微生物學。 2022;13:875840。 2022 年 6 月 2 日發布。 doi:10.3389/fmicb.2022。875840 (影響因子:5.640)
[7] 王婷, 任丹, 郭紅, 等. CgSCD1 對黑色素的生物合成和致病性至關重要 炭疽菌 膠孢屬。病原體。 2020;9(2):141。發表日期:2020 年 2 月 20 日。 2020 年 2 月 20 日發布。3390/病原體9020141(影響因子:3.018)
[8] 呂燕, 李曉玲, 張紅, 鄒鋒, 沈斌. 溴氰菊酯敏感和抗性細胞中的 circRNA 表現譜
淡色蚊(雙翅目:蚊科)。康普生物化學 Physiol B Biochem Mol Biol. 2022;261:110750。 doi:10.1016 /j.cbpb.2022.110750(影響因子:2.231)
[9] 胡梅, 戴欣.改變的 (p) ppGpp 抑制生長 水平是由於資源配置不優化造成的 大腸桿菌[J]。核酸研究,2019,47(9): 4684-4693.(影響因子11.6)
[10] 郭琳, 楊偉, 黃倩, 等.硒半胱氨酸特異性質譜揭示組織不同的硒蛋白質組和候選硒蛋白[J ]。細胞化學 生物學,2018,25(11):1380-1388。 e4。 (影響因子6.762)
2.6 使用 PCR 產物的出版品(部分)
[1] 王Y, 傅 Z, 李克斯, 等 等 細胞質 DNA感測 經過 堪薩斯州 複雜的 在 年齡 CD4+T細胞 細胞 增強 電視 細胞 艾克提瓦 化 和 與老化相關的 自體免疫 炎症。 免疫。 2021;54(4):632-647.e9。 道伊:10.1016/j.immu
ni.2021.02.003(影響因子:31.745)
[2] 楊X, 高 F, 張偉, 等 等 “星星” miR-34a 和 CXCR4 拮抗劑 基於 奈米複合材料 二進位是 合作 遷移處理 反對噸 轉移性 胸部 癌症。 J 控制 發布。 2020;326:615-627。 doi:10.1016/j。 jconrel.2020.07.029(影響因子:7.727)
[3] QiaoY, 杜傑, 葛 R, 等 等一個 樣本 和 偵測 微型針 修補 為了 牛皮癬 微小RNA 生物標誌物
分析 在 插頁式 液體.肛門 化學。 2022;94(14):5538-5545。 doi:10.1021/acs.analchem.1c04401(影響因子:6.986)
[4] 林 Q,葉X, 黃 Z, 等 等 石墨烯 氧化物基 抑制 的 非特異性 在 環介導 異硫氰酸 擴增不良 啟用敏感 偵測 環氧合酶2 信差核糖核酸 在 大腸直腸 癌症。肛門 化學。 2019;91(24):15694-15702。 doi:10.1021/acs.analchem.9b03861(影響因子:6.350)
[5] 林 問, 黃 Z,葉X, 等 等 實驗室 在 一個 管子: 隔離, 萃取, 和 是奧特馬爾 放大 偵測 的 外泌體 長的 非編碼 核糖核酸 胃的 癌症。塔蘭塔。 2021;225:122090。
doi:10.1016/j.tta.2021.122090(影響因子:6.057)
[6] 劉 C, 鄒 克, 等 等5-甲醯尿嘧啶 作為 一個 多功能 大樓 堵塞 在 生物感測器 設計[J]。安吉 化學 整數 艾德 英語。 2018年7月26日;57(31):9689-9693.(影響因子 11.992)
[7] 王 米, 張 年代, 鄭 克, 等 等 功能獲得 穆塔特離子 Card14 的 導致 自發性的 類似銀屑病 皮膚 發炎透過 增強型 角質形成細胞 回應 白細胞介素-17A。 免疫。 2018;49(1):66-79.e5。
doi:10.1016/j.immuni.2018.05.012(影響因子:19).734)
[8] 張Y, 鼎 H,王X, 等 等 MK2 促進 Tfcp2l1 降解 透過 β-谷氨酰酪胺酸 泛素 公升伊加塞 到 調節 老鼠 胚胎幹細胞 細胞自我更新。 細胞 Rep. 2021;37(5):109949。 doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (影響因子:9.423)
[9] 林 Q,葉X,楊 B, 等 等 即時的 螢光 環介導 等溫 放大的化 測定 為了 迅速的 和 敏感的 偵測 鏈球菌 解沒食子酸桿菌亞種 加洛利特重症監護室 與...相關 結腸直腸 癌症[J].
分析 和 生物分析 化學,2019,411(26): 6877-6887.(影響因子6.35)
[10] 林 Q,葉X, 黃 Z, 等 等 石墨烯 氧化物基 抑制 的 非特異性 在 環介導 異硫氰酸 擴增不良 啟用敏感 偵測 環氧合酶-2 信差核糖核酸 在 顏色切塔爾 癌症[J].分析 卡爾 化學,2019.(IF6.35)
引用:
[1] Loeb LA, Jr R. DNA聚合酶與人類疾病[J]。自然評論遺傳學。