了解凸輪藻蛋白A塗層的磁珠

本文介紹了刀豆球蛋白A的應用及其與磁珠的共價偶聯。

第 1 部分。 刀豆球蛋白A

刀豆球蛋白A包被磁珠（ConA珠），顧名思義，是一種由植物凝集素刀豆球蛋白A（ConA）與超順磁性奈米材料偶聯的生物磁珠。以下就ConA磁珠做一下簡單的介紹。

刀豆凝集素A(ConA)是一種沒有血型特異性的植物凝集素蛋白，是1936年以來第一個從烏賊豆(Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum)中分離純化並結晶的植物凝集素蛋白。

ConA 有兩種主要形式，取決於其所在溶液的 pH 值：α-2 同型二聚體或 α-4 同型四聚體 [2]。在鹼性條件下（pH>7.0）它以四聚體形式存在（由四個分子量為26 kDa的亞基組成）；在酸性條件下（pH 4.5-5.5），Con A 分解為活性二聚體結構（52 kDa）。此外，ConA 的功能也受二價陽離子的影響，例如，在沒有金屬離子（Ca2+ 和錳2+)，其構象和糖蛋白結合功能無法實現[1]。

圖（1）。 (A) ConA 單體、(B) ConA 二聚體、(C) ConA 四聚體與甘露糖、葡萄糖和金屬離子的分子建模。

第 2 部分 珠子

生物磁珠是一類由聚合物與無機磁性奈米粒子形成的具有奈米粒徑的磁性微球。磁珠依其結構可分為三類：核殼型結構、夾層型結構、彌散型結構。磁性材料包括純鐵粉、羰基鐵、磁性礦、正鐵氧體、鐵鈷合金等， 等人。

磁性奈米材料由於其具有小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應等特殊效應，在Fe3哦4 當奈米粒子的尺寸小於30nm時，奈米粒子內部熱擾動的干擾顯著，此時奈米粒子表現出一種特殊的磁性能，即超順磁性。超順磁性 Fe3哦4 奈米粒子因其無毒性、良好的生物相容性、獨特的磁靶向性、在交變磁場中易發熱等優質性能，在生物產業中得到了廣泛的應用。

相較之下，ConA與微球共價偶聯用於固定生物分子具有以下優點：

  • 共價偶聯結合穩定性高，可重複性佳；
  • 配體ConA結合在微珠表面，與標靶分子相互作用；
  • 溶液環境的動力學表徵，適用於生物實驗操作；

第 3 部分。 ConA磁珠的應用

根據文獻通報，ConA磁珠的主要應用分為3個場景，即進行細胞質膜分離，糖蛋白富集和固定化細胞物的分離。

應用一：細胞質膜分離

利用ConA磁珠受二價陽離子活化，使其存在於Ca2+ 和鎂2+ 利用末端α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的親和作用的溶液環境進行質膜純化是一種簡單、有效的方法。例如，細胞或組織的質膜分離是進一步獲取質膜蛋白的關鍵步驟。 ConA能夠與細胞上糖基化的蛋白質結合，利用此原理可以獲得純度更高的質膜。主要操作步驟為：將生物素化的ConA與鏈黴親和素磁珠結合，將ConA固定在磁珠上；將細胞膜與ConA磁珠孵育1h；磁力架吸附； TBS洗滌5次；並用洗脫液洗脫細胞質膜溶液[3]。

圖 2. ConA 磁珠純化質膜步驟

應用 II：糖蛋白富集

ConA 對甘露糖和葡萄糖具有特異性，可辨識 α-共軛甘露糖，而 α-共軛甘露糖恰好是許多血清和細胞膜糖蛋白的「核心寡糖」。因此，它可用於免疫學中分離細胞或組織裂解物或血清中的糖基化分子，如糖蛋白。

一個主要的程序是 透過雙功能接頭雙-N-羥基琥珀醯亞胺亞麻油酸酯（DSS）將氨基矽烷化磁性奈米珠（MNPs）與ConA交聯，得到ConA磁珠；利用甲氧基乙二醇（MEG）終止磁性奈米珠的非特異性結合，並進行磁分離；加入胰蛋白酶消化後的細胞膜蛋白萃取物，與ConA磁珠和捕獲的糖肽一起孵育，最後將捕獲的糖肽洗脫下來，真空乾燥。將ConA磁珠均孵育，用磁力架收集已經結合糖蛋白的ConA磁珠，洗滌非糖肽部分，最後將捕獲的糖肽洗脫並真空乾燥。此方法可以深入分析腫瘤相關蛋白（例如 EGFR）的特定糖基化位點[4]。

圖 3. 超順磁性奈米粒子與不同的凝集素偶聯

應用三：固定化細胞的分離

利用ConA磁珠（與高純度伴生蛋白Concanavalin A共價結合的磁珠）與細胞膜或核膜上的糖蛋白結合，從而捕獲細胞或細胞核，可以實現對少量細胞的實驗操作的可視化。例如CUT&Tag和CUT&RUN中使用ConA磁珠 [5] 染色質固定化實驗是研究染色質結構與功能的新技術，透過將ConA磁珠與細胞結合進行固定化，使操作更加直觀，避免了離心造成的細胞損失問題。

與研究DNA-蛋白質交互作用的傳統ChIP-seq技術相比，CUT&Tag和CUT&RUN具有以下優勢：

  • ConA磁珠與細胞膜糖蛋白結合，使操作更加視覺化，增強實驗操作體驗；
  • 無需離心，只需將ConA磁珠吸附於磁力架上即可完成細胞樣品與溶液的分離；
  • 只需 10 個細胞即可進行操作，從而避免了 ChIP-seq 對大量樣本的需求。

圖4. ChIP-seq、CUT&Tag、CUT RUN實驗流程示意圖

第 4 部分。 Yeasen 刀豆球蛋白 A 塗層磁珠

ConA 磁珠由 Yeasen，經過嚴格的原料篩選及多重製程優化改良，能夠快速、有效率、靈敏、特異地與醣蛋白、醣脂、多醣等經過糖基化修飾的分子結合。主要用於細胞分離，或用於細胞或組織裂解物或血清中的糖蛋白等糖基化分子的分離，特別是直接用於CUT&RUN、CUT&Tag（ChIP-seq實驗的創新技術）等實驗。

1.產品特性

  • 批量生產穩定，結果重現性較好；
  • 效能穩定的存儲
  • 細胞捕獲效率>90%

2.產品資訊

貨號

貨號：19810ES

尺寸

1毫升/5毫升/20毫升

顏色

棕黃色

珠子濃度

10毫克/毫升

固體含量

9-11毫克/毫升

珠子尺寸

1 微米

容量

105 細胞/µL 珠子

三、產品性能數據

（1）單分散性

在同樣的處理條件下，在10×/40×放大倍率下，ConA珠基本上呈現單分散性，相對於競爭對手沒有觀察到明顯的團聚現象。

Yeasen 原料珠

競爭對手的 ConA 珠子

Yeasen ConA 珠（貨號：19810）

圖 5. 單分散性結果圖

（2）ConA珠結合細胞的影響

將相同數量的細胞與珠子孵育相同的時間，在細胞分析儀下自動檢測ConA珠子結合後剩餘的細胞數，結果顯示 Yeasen ConA 珠（Cat#19810）的表現優於競爭對手的產品。

細胞懸浮液

競爭性 ConA 磁珠結合後剩餘的細胞

結合後剩餘的細胞 Yeasen ConA磁珠

圖 6.ConA 磁珠結合細胞圖片

（3）細胞結合數及重複性

10µL Yeasen ConA Beads（Cat#19810）和 10µL 競爭對手 ConA Beads 可結合與競爭對手相當的 E7 級細胞數量。重複操作下細胞捕獲率>90%。

圖 7. 結果 ConA 珠結合細胞數量和捕獲率

（4）加速穩定性

以 1 mL/管的量分配。保存條件為:4℃,37℃加速處理2、4、7、11、14 d,-20℃破壞處理1、3、6、8 d。結果顯示，在相同的實驗條件下：4℃保存、37℃加速處理、-20℃破壞處理的產品細胞捕獲率均>95%，且各處理條件下三組重複的CV值均在1%以內，表現出良好的重現性。

圖 8. 結果 溫度與時間下ConA磁珠的細胞捕獲率及重複性偏差的比較

訂購資訊

刀豆球蛋白 A 塗層磁珠

19810ES

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