如何選擇您的NGS適配器？
NGS Adapter是二代定序文庫的重要組成部分，扮演連接被偵測的DNA片段與Flow cell（定序晶片）的角色。接頭的效率是決定文庫品質和產量的重要因素。那什麼是NGS適配器呢？ NGS 轉接器有哪些常見類型？如何為您的定序平台選擇合適的NGS適配器？
1.什麼是NGS Adapter？
2. 選擇NGS指標需要考慮哪些因素？
3.常見的指數類型有哪些？
4. NGS適配器有哪些常見類型？
- UMI 轉接器
- 完整適配器
- 適配器不完整
- Tn5 轉接器
5. 如何為您的定序平台選擇合適的NGS適配器？
6. 關於閱讀
1.什麼是NGS Adapter？
NGS Adapter是定序中的一系列適配器，是一小段已知序列的核苷酸序列。它與目標核酸片段的兩端連接。定序時，它會透過與Flow cell上已知序列雜交來開始定序，將文庫結合到晶片上。那麼NGS適配器的結構是怎麼樣的呢？
以Illumina平台為例，一個NGS適配器可以分為三個部分：
P5和P7：與Flow cell上的P5和P7端結合的序列，將文庫固定在定序晶片上，以便透過Bridge-PCR進行成簇反應。
Rd1 SP 和 Rd2 SP（Read1/Read2 定序引子）：定序引子的結合區域，指示序列開始讀取的位置。
Index（又稱barcode）：一段已知的合成序列，用於在混合文庫定序中區分不同的樣本。
圖。 1 Illumina平台單索引文庫
圖。 2 MGI平台單端索引庫
隨著定序通量的提高，可以同時對多個樣本進行定序。因此如何區分不同的樣本就顯得格外重要。如前所述，NGS接頭的索引序列用於在次世代定序（NGS）中區分不同的樣本。選擇指數時該考慮哪些因素？請繼續閱讀...
2. 選擇指數時應考慮哪些因素？
索引長度一般為6nt~18nt,依索引數目分為單索引和雙索引。雙重索引位於待測試片段的兩端。選擇指數組合時應考慮鹼基平衡和螢光平衡。
基數平衡是指多個指數之間的平衡，而不是單一指數內的基數平衡。需要從鹼基類型和鹼基分佈兩方面來考慮。 組合原則是：同一組指標中的A/T/C/G四個鹼基需要納入，且這四個鹼基的比例接近，分別佔25%左右。
螢光訊號平衡是指在無法保證基礎平衡的情況下，選擇保證螢光訊號的平衡。在Illumina平台的4通道定序儀中，dG/dT標記為綠色螢光，dC/dA標記為紅色螢光。 在定序過程中，每個循環必須同時存在綠色和紅色螢光訊號才能確保定序成功。 因此，在選擇指標時應考慮綠色訊號和紅色訊號的平衡。
3.常見的指數類型有哪些？
常見的雙重索引通常包括唯一雙重索引（UDI）、唯一雙重條碼（UDB）和組合雙重索引（CDI），可顯著減少索引跳躍和錯誤分配。
UDI&UDB：兩端指標一一對應，分組設計，可兩端交叉驗證；
由 Illumina 提供的 Stubby UDI 引子套件
CDI：兩端的索引可以依照一定的要求進行組合，形成雙端索引庫；
Illumina 的 384 CDI 引物，Set1-Set2 由
Illumina為了提高通量和擴增效率，降低定序成本，在Novaseq等高通量定序儀上引入了陣列流動池（PFCT）和獨家擴增（ExAmp）聚類技術，但卻無意中放大了樣本標籤錯配現象和index hopping。
圖3 Illumina不同儀器型號採用非圖案化流動池或圖案化流動池
為了彌補HiSeq3000/4000、HiSeq X Series、NovaSeq等定序平台凸顯的index hooping問題，Illumina提出了將index放在文庫兩端的策略，可以進行雙邊驗證，剔除不匹配的adapter。當兩端使用唯一索引時，索引錯誤分配率將降低至0.01%。與先前常規的索引排列組組合方法相比，索引跳躍將減少兩個數量級。
在建構無PCR文庫時，可使用單端標籤接頭。標籤不匹配主要是由於定序錯誤造成的。整體來說，標籤錯配率較低（平均0.0004%，最高0.001%）。然而，在建立標靶擷取文庫時，由於多個步驟會導致標籤不匹配，並且通常使用UDI/UDB/CDI適配器，因此串擾問題被放大。
4.NGS適配器有哪些常見類型？
隨著定序技術的發展，接頭的種類越來越多，例如單索引/雙索引接頭（如第3節所述）、UMI接頭、轉座酶接頭、完全/不完全接頭等等，適用於各種各樣的應用場景。本部分有系統地整理了這些適配器，為您提供適配器選擇的基礎。
4.1 UMI 適配器
唯一分子識別碼（UMI）適配器是低頻突變檢測和絕對定量的利器。 UMI是具有已知序列的隨機合成序列。它可以設計為完全隨機的核苷酸鏈、部分簡併的核苷酸鏈或固定的核苷酸鏈。長度通常為10nt（單端UMI）或5-8nt（雙端UMI）。其作用是凍結擴增前DNA片段的狀態，每個DNA分子對應一個UMI。因此在生物資訊分析過程中，可以區分出不同來源的DNA模板，區分哪些是PCR擴增和定序過程中隨機誤差造成的假陽性突變，哪些是病人真正攜帶的，從而濾除背景噪音，實現低頻、極低頻突變的精準檢測，對不同的DNA分子進行絕對定量。在低頻突變檢測中有著廣泛的應用，特別是在腫瘤研究領域。
圖4 UMI適配器示意圖 Illumina平台結構
4.2 完整適配器
Complete adapters是PCR-free文庫的必備產品，包含了定序所需的所有序列，例如Illumina平台中的P5、P7、RdS1、RdS2等，也根據定序要求包含了index序列和UMI序列。由於接頭齊全，無需透過PCR引入其他接頭，可直接定序。因此，可以使用完整的接頭來建立無 PCR 文庫。 PCR-free文庫可以降低PCR擴增偏差、錯誤率、以及序列重複，增加一些在群體基因組研究中廣泛使用的高GC或高AT區域的覆蓋率。
由 Illumina 平台提供的完整適配器產品
由MGI平台提供的完整適配器產品
圖5 完整適配器圖
4.3 不完整的適配器
不完整的接頭需要在接頭連接後透過PCR引入其他序列才能形成完整的接頭。它們的特點是連接效率高，有效庫率高。 PCR過程對於全庫來說是一個富集作用，保證有效文庫的濃縮，同時也可以引入雙端索引和UMI序列。
4.4 Tn5 適配器
Tn5接頭透過Tn5的限制性內切酶活性將部分接頭序列連接到DNA片段的兩端。它們使碎片化和接頭連接同時進行，以節省時間和樣品。最後透過PCR引入剩餘的linker序列、index、UMI以及其他序列，形成完整的文庫。它可用於建立剪切&標籤庫。
圖6 Tn5接頭文庫建置示意圖
5. 如何為您的定序平台選擇合適的NGS適配器？
目前，主流的定序平台有兩大：Illumina和華大智造。
就 Illumina 平台而言，Illumina NGS 適配器由
齊全且UDI的NGS轉接器，無需擔心耦合問題，適合追求簡單易用的客戶； CDI NGS 轉接器管子較少，體積較小，適合想要方便存放和攜帶的客戶。 PCR-free需要使用完整的NGS適配器。
對於 Illumina
| 管道 | 希夫NGS® 德NA 圖書館準備 384 CDI 引子（適用於 Illumina），第 1 組（8*12，96 個索引） | 12412ES |
| 希夫NGS® 德NA 圖書館準備 384 CDI 引子（適用於 Illumina），第 2 組（8*12，96 個索引） | 12413ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 引子（適用於 Illumina），第 1 組（96 個索引） | 12414ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 引子（適用於 Illumina），第 1 組（96 個索引） | 12415ES | |
| 在盤子裡 | Hieff NGS® Stubby UDI 引子試劑盒（適用於 Illumina）（1-384 索引）套裝 1-4 | 12407ES |
| 適用於 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引子試劑盒 集合1（96 孔板，1-96 索引） 集合 1 | 12327ES | |
| 適用於 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引子試劑盒 集合2（96 孔板，97-192 索引） 第 2 組 | 12328ES | |
| 適用於 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引子試劑盒 集合3（96 孔板，193-288 索引） 第 3 組 | 12329ES | |
| 適用於 Illumina 的 Hieff NGS® Stubby UDI 引子試劑盒 套裝4（96 孔板，289-384 索引） 第四組 | 12330ES |
對於MGI
| 希夫 新一代定序™ 適用於 MGI、Set1/Set2 的雙 UMI UDB 適配器套件 | 96 指數種類 | |
| 希夫NGS™ MGI 完整轉接套件， Set1/Set2/Set3(詢問) | 13360ES | 8 指數種類，41-48 |
| 13361ES | 16 指數種類，57-72 | |
| 13362ES | 96 索引種類，1-96 |
關於閱讀
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