NGS中各類磁珠：DNA\RNA\mRNA磁珠
磁珠是高通量定序文庫建構的必需產品之一。它們可以純化 DNA 或 RNA、篩選目標大小的 DNA 片段並富集目標核酸。隨著定序技術的發展，出現了專門針對不同應用領域的磁珠，包括DNA純化磁珠、DNA大小選擇磁珠、RNA純化磁珠、mRNA富集磁珠等。 那麼各種磁珠的原理都有哪些呢？如何選擇？
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1. DNA 珠
2. 星形DNA珠介紹
3. RNA 純化珠
4. 富集mRNA的磁珠
5.
1. DNA 珠
1.1 基本原理
磁珠純化核酸的原理是基於固相可逆固定化（SPRI）。在特定條件下，核酸選擇性地與磁珠結合，而污染物則留在溶液中。施加磁場後，與目標分子結合的磁珠從溶液中分離出來，然後將磁珠清洗，進一步去除污染物。由於磁珠與核酸分子的結合是可逆的，因此可以用低鹽緩衝液將核酸從磁珠中洗脫出來。
磁珠外表面改質有矽羥基或羧基官能基。在含有PEG和高鹽離子的純化緩衝體系中，DNA透過DNA鹽離子羧基形成離子橋與珠子結合。這種結合是可逆的。在不含PEG和鹽離子的TE緩衝液中去除離子橋，最後純化DNA。基於羧基磁珠，不同的磁珠輸入和純化緩衝液將結合不同的片段大小。磁珠優先結合大片段的DNA，因此第一輪先用磁珠結合大於目標片段的片段，保留上清；第二輪，磁珠與上清液中的目的片段結合，然後棄去上清液；最後，目標片段從磁珠上洗脫下來，得到目標大小的DNA片段。
圖 1. 羧基磁珠結構
圖2. DNA純化磁珠原理
1.2 操作流程
圖 3. DNA 純化步驟
圖 4. DNA 大小選擇步驟
1.3 磁珠使用技巧
提高產量並準確選擇尺寸
（1） 使用前充分混合，並平衡 將磁珠放置於室溫下至少30分鐘。
——PEG在磁珠中的溶解度 緩衝液容易受到pH值和溫度的影響。使用前，必須平衡 至室溫 磁珠懸浮均勻，PEG充分溶解，避免影響吸附分離效果
（2） 吸附時間要充足，充分混合 使吸附充分；
（3） 純化或分離過程中以80％乙醇洗滌；
——在80%乙醇下，核酸脫水並聚集緊密，不會溶解。用乙醇清洗體系中殘留的酵素、緩衝液、雜質等，得到更純淨的 圖書館.
（4） 在尺寸選擇時，確認樣本量，確保磁珠添加比例正確；
——尺寸選擇時需要準確輸入相應體積的磁珠，確保比例準確，因為緩衝液中PEG和鹽離子濃度的變化可能會影響結果。
（5） 在洗脫步驟之前，讓酒精完全揮發，但 防止珠子 過度乾燥
——一般2~3min即可乾燥。當磁珠數量較多，乾燥困難時， 建議在多個離心管中操作。
（6） 如果磁珠結塊或結塊，洗脫時間 可以擴充 充分攪拌後；
——可能是因為 DNA 中的雜質或 乾燥時間太長。一般情況下，當DNA中雜質較多時，建議先純化 前 尺寸選擇。
2. 星形DNA珠介紹
Hieff NGS™ DNA選擇磁珠基於SPRI（固相逆固定化）原理，採用進口磁珠原料，配合優化的緩衝體系，可用於NGS文庫建構過程中的DNA片段大小選擇與純化。其使用方法與所使用的AMPure XP beads相同，片段回收效率和文庫大小分佈與其高度一致。
2.1 淨化性能介紹
- 獨特的緩衝系統：DNA片段低至 可恢復50bp。
- 回收率高：≥90%。
- 有效去除雜質：有效去除引子二聚體、dNTP、無機鹽類、蛋白質等雜質。
- 適用範圍廣：適用於酶切、連接、克隆、NGS建庫等場景的DNA純化。
表 1. 不同配比磁珠的DNA純化回收效率
| 體驗組 | 本批次磁珠回收濃度(ng/μL) | 回收率 | AMPure XP 珠組(ng/μl) ④ | 回收率 | 履歷％ | |||
| 比率 | ① | ② | ③ | 平均的 | ||||
| 1.8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96.92％ | 22.2 | 94.37％ | 2.55％ |
| 0.8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82.19％ | 17.8 | 75.67％ | 6.52% |
| 0.6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42％ | 16.2 | 68.87% | 2.55％ |
圖 5. 磁珠純化效果瓊脂糖凝膠電泳結果
M：1kb DNA梯狀物；
2.2 尺寸選擇性能
- 簡單的 到 操作：分離原理及實驗操作與XP磁珠完全一致
- 精準大小選擇：分選出的片段大小準確、穩定
- 適用性廣：適用於 大樓 DNA 和 RNA 文庫及適應 各種樣本類型的片段大小選擇
- 超高性價比：品質穩定，價格更經濟，售前售後服務更周到
圖 6. DNA 大小選擇結果
3. RNA 純化珠
Hieff NGS™ RNA清潔劑基於SPRI原理，可高效去除蛋白質、鹽離子等雜質，獲得高純度的濃縮RNA樣本，並精心優化的酸性緩衝體系，維持RNA結構的穩定性，防止RNA降解。適用於RNA文庫建構、去除rRNA後總RNA樣本的純化、體外轉錄的RNA產物的純化、RNA標記產物的純化、合成RNA的純化等。
- 高品質： 採用進口原料，品質高度穩定
- 優化的緩衝體系：確保RNA的純度與完整性，有效防止RNA降解
- 高效率： 高效回收，適用於RNA文庫建構或體外 轉錄產物回收等
圖7. 不同樣品純化後電泳圖
4. 富集mRNA的磁珠
4.1 mRNA分離原理
mRNA分離富集磁珠是表面經過寡核苷酸（dT）修飾的磁珠。它們透過雜交原理，特異性地結合帶有Poly A尾巴的mRNA，從而從總RNA或組織細胞中特異性地分離mRNA。此試劑盒優化了產品配方，能從動物、植物、昆蟲及真核微生物的細胞和組織RNA中高效分離高純度的完整mRNA。
圖 8.mRNA磁珠富集純化原理
4.2 mRNA分離珠性能
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit 由
- 高效率：45分鐘內即可完成mRNA純化
- 高純度： 寡核苷酸（dT）磁珠特異性結合mRNA
- 可靠的： 所得的 mRNA 適用於體外 NGS 翻譯、RT-PCR 和 cDNA 合成
圖 9. mRNA 分離試劑盒純化不同 RNA 檢體中的 mRNA
註：看家基因產量代表mRNA恢復的效果。 rRNA相關基因產量 表徵 rRNA 去除效率
4.3 mRNA磁珠常見問題解答
（1） 磁珠為什麼會結塊以及怎麼解決？
——磁珠 聚集會降低mRNA的產量和純度。樣本可能含有許多雜質，例如多醣體、蛋白質和長鏈DNA。這些雜質會導致磁珠 集聚。解決方法是透過移液器吹出磁珠。 純化之前可以透過 DNase 處理去除基因組 DNA。 如果初始樣本量太大，超出了磁珠的負載，磁珠也會團聚。建議按照手冊的輸入量進行操作。
（2） 為什麼mRNA產量低？
——造成mRNA產量低的原因有很多：
- 由於細胞或組織的mRNA表現量較低，可選擇適當表現期間的樣本或適當增加樣本總RNA輸入量。
- 磁珠與樣本的比例過低，影響mRNA與磁珠的結合。嘗試增加 增加磁珠數量或減少樣本輸入量和體積。
- 雜交時間太短，可將孵育時間增加至10-15min；
- 洗脫不充分，需適當增加洗脫緩衝液的體積，增加洗脫時間及溫度，或重複洗脫步驟兩次。
（3） 如何有效消除rRNA？
——若操作不當，純化過程中rRNA會隨mRNA非特異性結合到磁珠上， 尤其是當總RNA輸入量很大時。 純化過程中通常採用兩輪結合 有效避免rRNA污染。 確保在洗滌實驗過程中充分混合，以去除非特異性結合，並盡量去除rRNA污染。
（4） 對於許多下游應用來說，是否需要洗脫mRNA，磁珠是否會幹擾下游的酵素反應？
——有些下游反應可直接用磁珠進行而不需洗脫mRNA，例如RNA文庫建構中的mRNA片段化和逆轉錄。但如果要進行PCR反應，就必須確保沒有基因組DNA污染，否則會產生許多基因組擴增片段，幹擾實驗結果。具體操作可依照相應下游反應的說明進行，如RNA-Seq文庫構建
（5） 該試劑盒能直接從細胞或組織分離 mRNA 嗎？
——不推薦！ 裂解物中含有一些會影響 mRNA 結合的成分。建議使用專用套件。
5. Yeasen 磁珠產品推薦
Hieff NGS™系列磁珠作為
表 2.
| 產品名稱 | 貓＃ | 規格 | 使用和應用場景 |
| 希夫NGS™ DNA 選擇珠 | 12601ES03 | 1 毫升 | 👉新一代定序DNA 純化和尺寸選擇 👉PCR 產物純化 👉酶切和連接產物的純化 |
| 12601ES08 | 5 毫升 | ||
| 12601ES56 | 60 毫升 | ||
| 12601ES75 | 450 毫升 | ||
| 希夫NGS™ RNA 清潔劑 | 12602ES03 | 1 毫升 | 👉RNA純化 👉去除 rRNA 後總 RNA 樣本的純化 👉RNA標記產品的純化 |
| 12602ES08 | 5 毫升 | ||
| 12602ES56 | 60 毫升 | ||
| 12602ES75 | 450 毫升 | ||
| Hieff NGS™ mRNA 分離主試劑盒 | 12603ES24 | 24 T | 👉mRNA分離純化 👉體外轉錄 mRNA 純化 |
| 12603ES96 | 96噸 |
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