HEK293 宿主細胞殘留 DNA 片段分析試劑盒專為 對生物製劑中間體、半成品、最終產物中HEK293殘留的各種長度的DNA片段進行定量分析。本試劑盒採用qPCR螢光探針原理，可特異性、快速地檢測200個鹼基對以下及以上的HEK293 DNA殘基，定量限低至10 fg/μL。它還包括 HEK293 DNA 控制（DNA 定量參考）。本試劑盒可與本公司以磁珠為基礎的殘留DNA樣本製備試劑盒搭配使用（編號：18461ES/18462ES）。

產品資訊

成分

儲存和運輸：

1. 所有組件均在乾冰中運輸，收到後應儲存在 -25°C 至 -15°C 的溫度下。保存期限為2年。組分 A 和 B1、B2、B3 和 B4 應避光保存。

2. 收到後，請檢查所有 7 個組件是否存在，並立即將它們存放在建議的溫度下。

預防措施:

1. 本產品僅供研究目的使用。

2. 為了安全和健康原因，操作時請穿著實驗服和戴上一次性手套。

3. 使用該試劑前，請仔細閱讀使用說明書。實驗應依照標準程序進行，包括樣品處理、反應混合物的製備及移液。

4. 使用前應將各成分輕輕搖晃並短暫離心，充分混合。

相容儀器：

包括但不限於以下儀器： 賽默飛世爾科技：ABI 7500、ABI Quant Studio 5、ABI Step OnePlus， Bio-Rad：CFX96 光學模組， 上海宏實醫療科技：SLAN-96S

使用說明

1. HEK293 DNA 對照定量參考的稀釋及標準曲線的製備

HEK293片段分析試劑盒包含四個不同長度的擴增片段：82bp、133bp、227bp、515bp。建立標準曲線時，對每一個擴增片段分別建立曲線，並根據對應的標準曲線計算其殘留量及相對分佈。

使用試劑盒中提供的DNA稀釋緩衝液對HEK293 DNA對照定量參考進行梯度稀釋。稀釋濃度應為：3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL 及 30 fg/μL。

詳情如下

1）。將試劑盒中的 HEK293 DNA 對照組和 DNA 稀釋緩衝液放入冰上解凍。完全解凍後，輕輕渦旋混合，短暫離心（10 秒）以收集管底的溶液。

2）。準備六個乾淨的 1.5 mL 離心管，並將其標記為 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4 和 Std5。

3）。在標示 Std0 的管中，加入 90 μL DNA 稀釋緩衝液和 10 μL HEK293 DNA 對照，以達到 3 ng/μL 的濃度。輕輕渦旋混合並短暫離心（10 秒）。此濃度可分裝並儲存於-20°C 以供短期使用（最多 3 個月）。避免反覆凍融。

4）。 在標示 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4 和 Std5 的管中，首先在每個管中加入 90 μL DNA 稀釋緩衝液。每個稀釋步驟應輕輕混合並短暫離心以確保均勻性。 然後進行漸變 稀釋如下：

表 1：標準梯度稀釋

* 對於每個濃度，進行 3 次重複。該試劑可在300 pg/μL至30 fg/μL的線性範圍內進行檢測。如果需要，可以適當擴大或縮小線性範圍。

** 為了減少反覆凍融循環並避免污染，建議分裝並儲存 DNA 定量 s首次使用時標準溫度為-20°C。

*** 未使用的解凍 DNA 稀釋液可在 2-8°C 下保存長達 7 天。如果長期不使用，請將其存放在-20°C 下。

**** 為了確保模板完全混合，請輕輕搖晃每個梯度稀釋液約 1 分鐘。

2. 測試樣品（TS）的製備

根據實驗設定準備測試樣品 TS，如下所示：

1) 取100 μL檢測樣品，加入1.5 mL乾淨的離心管中。將其標記為TS，進行樣品前處理，並準備o 普利夫是 測試樣本。

2)為滿足同時分析四種不同延伸長度的要求，預處理後的測試樣品量應≥120 μL。因此建議每個樣本準備2管進行預處理，並提取後混合在一起使用。

3. 製備陰性萃取對照 (NCS)

根據實驗設定準備陰性萃取控制 NCS，如下所示：

1) 取 100 μL 樣本基質溶液（或 DNA 稀釋液 緩衝)加入到一個1.5 mL乾淨的離心管中。將其標記為 NCS。

2)將陰性對照NCS與此批次測試樣本一起進行樣本預處理，製備純化的陰性對照NCS溶液。

3)為滿足同時分析四種不同延伸長度的要求，預處理的NCS樣品量應≥120 μL。因此建議每個NCS樣本準備2管進行預處理，萃取後混合在一起使用。

4. 無模板對照 (NTC) 的製備

根據實驗設定準備無模板控制 NTC，如下所示：

1) 無模板對照（NTC）不需要樣品 預處理， 並且可以從使用 qPCR 檢測殘留 DNA 含量的階段開始準備。

2) 對於每個管或孔，NTC 樣本由 20 μL 混合物（即 15 μL HEK293 qPCR 混合物 + 5 μL 對應的 HEK293 引子和探針混合物）+ 10 μL DNA 稀釋緩衝液組成。建議準備足夠的 3 個重複孔。

5. qPCR反應體系

桌子 2。 反應體系 為了 82 bp 片段

桌子 3。 反應體系 133 bp片段

桌子 4。 反應體系 2 人份27 bp片段

桌子 5。 反應體系 515 的 bp片段

* 根據孔數計算此反應所需的混合物總量：

混合 = (反應孔數 + 2) × (15 + 5) μL（考慮 2 個孔的損失）。通常，每個樣本準備 3 個重複孔。

** 反應孔數=（5個濃度梯度標準曲線孔+1個無模板對照（NTC）+1個陰性對照液（NCS）+N個檢測樣本（TS））×3。

NTC（無模板對照）：DNA 稀釋緩衝液

NCS（陰性對照溶液）：樣本預處理後的樣品基質溶液或DNA稀釋緩衝液-治療 得到純化溶液，即NCS。

TS（測試樣品）：需要測試的樣品。

***分配樣本並密封試管後，短暫低速離心（10秒），將液體從管壁收集到管底。然後渦旋至少 5 秒鐘以徹底混合。然後，再進行一次低速離心（10秒）。如果有氣泡，請務必將其除去。

表 6：參考板佈局

這個例子 展示s 用於分析殘留 HEK293 DNA 擴增片段的 qPCR 檢測程序。檢測樣本包括：HEK293 DNA標準曲線5個濃度梯度，1個檢測樣本（TS），1個陰性對照液（NCS），1個無模板對照（NTC）。建議每個樣本運行 3 個重複孔。

6. 擴增程序參數（T韓步法） （以 ABI 7500 qPCR 儀器、軟體版本 2.0 為例）**

1) 新建一個空白程序，選擇「絕對定量」作為偵測模板。

2)針對四種不同的擴增片段長度，創建新的檢測探針，將其命名為「HEK293-82」、「HEK293-133」、「HEK293-227」和「HEK293-515」。選擇報告螢光團為“FAM”，選擇猝滅螢光團為“無”。將檢測的參考染料設定為“ROX”（根據儀器型號和其他因素，可能添加或不添加參考染料）。

3) 在「Assign target(s) to the selected wells」面板中，將標準曲線孔的「Task」欄位設定為「Standard」，並在「Quantity」欄位中分別賦值「300000」、「30000」、「3000」、「300」、「30」（每孔）。將「樣本名稱」欄位中的孔命名為「300 pg/μL」、「30 pg/μL」、「3 pg/μL」、「300 fg/μL」、「30 fg/μL」。對於 NTC 井，將「任務」設定為「NTC」。對於 NCS 和 TS 孔，將“任務”設為“未知”，並在“樣本名稱”欄位中將孔命名為“NCS”和“TS”。設定這些參數後，按一下「開始運作」即可開始儀器運作。

4)擴增程序設定：設定三步驟擴增程序，反應體積為30 μL。

桌子7. PCR 程式

7. qPCR結果分析

1) 在「擴增圖」下的「分析」面板中，系統會自動設定「閾值」。有時，預設的「閾值」太接近基線，導致重複之間的 Ct 變化顯著。您可以手動調整“閾值”到合適的位置，然後點擊“分析”。此時，可以初步檢查「多組分圖」中的擴增曲線是否正常。

2) 在「標準曲線」下的「分析」面板中，可以讀取標準曲線的R²、擴增效率（Eff%）、斜率、截距。對於正常的標準曲線：R² > 0.99，擴增效率 (90% ≤ Eff% ≤ 110%)，斜率在 -3.6 和 -3.1 之間。

3) 在「View well table」下的「Analysis」面板中，可以看到無模板對照（NTC）、陰性對照（NCS）、測試樣本（TS）的「Quantity」列，單位為fg/μL。單位可以稍後在報告中轉換。

4) 結果分析的參數設定需根據特定的儀器型號和軟體版本而定。通常，儀器可以自動解釋結果。

5)陰性對照（NCS）的Ct值應大於標準曲線最低濃度的平均Ct值。

6) 無模板對照（NTC）的結果應為「未確定」或Ct值≥32。

文件

手動的