الميكوبلازما، المعروفة أيضًا باسم الكائنات الحية الشبيهة بالالتهاب الرئوي البلوري (PPLO)، هي أصغر وأبسط بدائيات النوى التي تم اكتشافها حتى الآن والتي تفتقر إلى جدار خلوي. يبلغ قطرها من 0.1 إلى 0.3 ميكرومتر، ويمكنها المرور عبر المرشحات، وتظهر تعدد الأشكال بدرجة عالية. وهي شائعة نسبيًا ويصعب اكتشاف الملوثات البكتيرية في مزارع الخلايا الثديية
إن تلوث الميكوبلازما له تأثيرات سلبية متعددة على مزارع الخلايا وأصبح قضية خطيرة في ممارسات زراعة الخلايا. ومن المقدر بشكل متحفظ أن معدل تلوث الميكوبلازما في مزارع الخلايا الروتينية يتراوح من 15% إلى 35%، وهو ما يتعارض بشكل خطير مع مصداقية النتائج التجريبية.
حوالي 95% من تلوث الميكوبلازما في مزارع الخلايا ناتج في المقام الأول عن Acholeplasma laidlawii وMycoplasma arginini وMycoplasma orale وMycoplasma fermentans وMycoplasma hominis وMycoplasma hyorhinis. على وسائط الزراعة، تشكل مستعمرات الميكوبلازما مظهر "البيض المقلي". توفر السوائل الخلوية وأغشية الخلايا بيئة مناسبة لنمو الميكوبلازما، ويمكن للميكوبلازما التي تتطفل على سطح الخلايا أن تخترق غشاء الخلية المضيفة.
تشمل المصادر الرئيسية لتلوث الميكوبلازما ما يلي: وسائط زراعة الخلايا أو مكوناتها (مثل المواد الخام للوسط والمصل والكواشف الأخرى)، وموظفي المختبر، وحاضنات زراعة الخلايا، وخزانات تخزين النيتروجين السائل، والجسيمات المحمولة جواً والهباء الجوي، والإفراط في استخدام المضادات الحيوية، وثقافات الخلايا المغلقة بشكل غير صحيح، والخلايا الملوثة بالفعل بالميكوبلازما.
وفي الوقت نفسه، تشمل المخاطر المقابلة لهذه التلوثات ما يلي: التسبب في التخلص من دفعات من منتجات الخلايا أو المنتجات المنتجة باستخدام الخلايا كوسيلة بسبب عدم القدرة على إزالة الميكوبلازما بشكل فعال أثناء التنقية اللاحقة؛ تلويث جميع المعدات والمرافق ذات الصلة، وكذلك المنتجات الوسيطة أو النهائية، التي تتلامس مع المواد الملوثة؛ التسبب في تلوث خلايا طبيعية أخرى بالميكوبلازما؛ مما يؤدي إلى التخلص من بنوك البذور الخلوية أو الفيروسية المهمة بسبب تلوث الميكوبلازما؛ إجبار المختبر على وقف الإنتاج أو العمليات التجريبية لمعالجة تلوث الميكوبلازما؛ مما يؤدي إلى تطوير مقاومة الميكوبلازما، مما يجعل القضاء عليها أكثر صعوبة؛ توسيع منطقة تلوث الميكوبلازما؛ ويشكل تهديدًا لثقافات الخلايا الأخرى في المختبر.
لذلك، يجب إجراء اختبارات وإزالة الميكوبلازما بشكل منتظم للتأكد من عدم وجود الميكوبلازما في نظام زراعة الخلايا، وهو أمر ضروري للتقدم الطبيعي للبحث العلمي.
الميكوبلازما كشف
الميكوبلازما هي نوع شائع نسبيًا من التلوث، ولكن من الصعب عادةً إزالته. بالنسبة للعمليات البيولوجية التي تنطوي على زراعة الخلايا، تتطلب اللوائح "عدم وجود تلوث بالميكوبلازما".
- تنص طبعة عام 2020 من دستور الأدوية الصيني، المجلد الثالث، "إعداد ومراقبة جودة ركائز الخلايا الحيوانية لإنتاج واختبار المنتجات البيولوجية"، على أنه بالنسبة للخلايا المستخدمة في الإنتاج، يجب إجراء اختبار الميكوبلازما في بنك الخلايا الرئيسي (MCB)، وبنك الخلايا العاملة (WCB)، وخلايا نهاية الإنتاج (EOPC).
- تنص إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، في إرشاداتها للصناعة: توصيف وتأهيل ركائز الخلايا والمواد البيولوجية الأخرى المستخدمة في إنتاج اللقاحات الفيروسية لمؤشرات الأمراض المعدية، على أنه يجب إجراء مكافحة الميكوبلازما على المواد الخام وبذور الفيروسات وسوائل الحصاد غير المعالجة وغيرها من هذه المواد.
- كما ذكر ICH Q5D، "اشتقاق وتوصيف ركائز الخلايا المستخدمة في إنتاج المنتجات التكنولوجية الحيوية/البيولوجية"، أن مكافحة الميكوبلازما يجب أن تتم على المواد الخام، وبذور الفيروسات، وسوائل الحصاد غير المعالجة، وغيرها من هذه المواد.
الشكل 1 نقاط اختبار تلوث الميكوبلازما المطلوبة بموجب اللوائح المحلية والدولية
تتضمن طرق الكشف التقليدية عن الميكوبلازما بشكل أساسي طرق الثقافة وطرق الخلايا المؤشرة. ومع ذلك، نظرًا لدورات الكشف الطويلة أو مشكلات الحساسية لهاتين الطريقتين، فإنها تؤدي إلى دورات إنتاج أو إطلاق منتج ممتدة للمؤسسات. مع تطور العلاج الخلوي والجينات، أصبحت متطلبات الصناعة فيما يتعلق بالتوقيت والحساسية للكشف عن الميكوبلازما صارمة بشكل متزايد. لا تكفي فترات التخزين القصيرة لدعم فترات الكشف الطويلة هذه، ولهذا السبب برزت طريقة NAT (اختبار الحمض النووي السريع) بين طرق الكشف عن الميكوبلازما المختلفة.
الشكل 2 طرق الكشف عن الميكوبلازما المدرجة في اللوائح المحلية والدولية
استنادًا إلى تقنيات تضخيم الأحماض النووية (NAT)، طورت Yeasen سلسلة من مجموعات الكشف السريع عن الميكوبلازما، بما في ذلك مجموعة الكشف عن الميكوبلازما في الوقت الحقيقي qPCR، ومجموعة الكشف عن الميكوبلازما MycAway™ Plus-Color One-Step، ومجموعة اختبار الميكوبلازما GMyc-PCR.
1.مجموعة الكشف عن الميكوبلازما في الوقت الحقيقي qPCRإنه منتج للكشف السريع عن التلوث المحتمل بالميكوبلازما في المواد الخام للإنتاج وبنوك الخلايا والبذور الفيروسية وسوائل حصاد الفيروسات أو الخلايا والخلايا العلاجية. يستخدم بشكل أساسي في عمليات البحث والتطوير والإنتاج والإطلاق للمستحضرات الصيدلانية الحيوية.
مؤهلات المنتج
الامتثال التنظيمي: تم التحقق من صحته وفقًا لمتطلبات دستور الأدوية EP2.6.7 وJP G3 وUSP 63، وتلبية معايير المنظمات الدولية المعتمدة.
الامتثال للتدقيق: يتوافق إنتاج المنتج مع معايير نظام إدارة الجودة ISO13485 ويتم دعمه من خلال وثائق التدقيق الشاملة.
ضمان الجودة: جميع المواد الخام الإنزيمية المطلوبة للمجموعة يتم إنتاجها ذاتيًا وتم تصنيعها، مما يضمن إمدادًا مستقرًا.
تراكم الخبرة الفنية: هناك أساس تقني متين في طريقة TaqMan، ويمكن أن تصل حساسية الطقم إلى 10 CFU/mL وما دون.
التركيز على أداء المنتج: تعمل مكتبة الأجسام المضادة الإنزيمية Taq، مع الأجسام المضادة ذات الحظر المزدوج، على تعزيز خصوصية المجموعة وحساسيتها واستقرارها.
مميزات المنتج
أنواع الكشف المتعددة: يمكن لمسبارات TaqMan المحسّنة اكتشاف ما يصل إلى 183 نوعًا من الميكوبلازما.
سهل الاستخدام: يبلغ الوقت الإجمالي لإعداد العينة واختبارها أقل من 3 ساعات، مما يلغي الحاجة إلى الانتظار لمدة 28 يومًا المرتبطة بأساليب الثقافة.
حساسية عالية: يصل حد الكشف إلى 10 CFU/mL، مما يجعله بديلاً قابلاً للتطبيق لطرق الثقافة المباشرة.
خصوصية عالية: تم تصميم البادئات والمجسات لاستهداف 16S rRNA، مما يضمن عدم حدوث تفاعل متبادل مع الأنواع ذات الصلة الوثيقة مثل كلوستريديا والعصيات اللبنية.
سلامة عالية: إن التحكم الإيجابي (PC) الموجود في المجموعة غير معدي، مما يزيل خطر التلوث تمامًا.
مقاومة قوية للتداخل: يساعد إدخال نظام التحكم الداخلي (IC) على استبعاد تداخل العينة والتشوهات في تحضير التفاعل، وتجنب النتائج السلبية الكاذبة بشكل فعال.
الشكل 3 سير العمل لاكتشاف الميكوبلازما باستخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما في الوقت الحقيقي qPCR
2. مجموعة MycAway™ Plus-Color للكشف عن الميكوبلازما بخطوة واحدةيستخدم تقنية تضخيم متساوية الحرارة فريدة من نوعها، مما يوفر تمييزًا أعلى للألوان. يمكن تمييز التغيير من اللون الأزرق البنفسجي (السالب) إلى الأزرق السماوي (الإيجابي) بسهولة أكبر بالعين المجردة. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن مكونات مضادة للتلوث للقضاء على حدوث نتائج إيجابية كاذبة.
الشكل 4: إجراءات التشغيل لاكتشاف الميكوبلازما باستخدام مجموعة اكتشاف الميكوبلازما MycAway™ Plus-Color One-Step
3.GMyc-PCR الميكوبلازما كشفعدةعلى عكس طرق الكشف التقليدية عن تفاعل البوليميراز المتسلسل بخطوة واحدة، يتم زيادة عدد البادئات من زوج واحد إلى ثلاثة أزواج، مما يستهدف المناطق المحفوظة من rRNA الميكوبلازما 16S و23S لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. وهذا لا يقلل فقط من المنتجات غير المحددة ولكنه يعزز أيضًا حساسية المنتج بشكل كبير، مما يسمح باكتشاف نسخة واحدة فقط من الميكوبلازما.
、
الشكل 5 إجراءات التشغيل للكشف عن الميكوبلازما باستخدام مجموعة اختبار الميكوبلازما GMyc-PCR
إزالة الميكوبلازما
في عملية زراعة الخلايا، يمكن للاختبار المنتظم أن يمنع بشكل فعال تلوث الميكوبلازما على نطاق واسع. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا ملوثة بالفعل بالميكوبلازما، فيجب التعامل معها على الفور. أفضل ممارسة هي تعقيم الخلايا الملوثة تحت ضغط عالٍ ثم التخلص منها لتجنب تلويث خطوط الخلايا النظيفة الأخرى. إذا كانت الخلايا الملوثة ذات قيمة خاصة وكان من الضروري إزالة تلوث الميكوبلازما، فيمكن استخدام مجموعة من المضادات الحيوية لتحقيق هذا الهدف. نظرًا لأن الميكوبلازما تفتقر إلى جدار خلوي، فإن المضادات الحيوية التقليدية غير فعالة ضدها بشكل عام. لذلك، فإن اختيار كاشف إزالة الميكوبلازما المناسب أمر بالغ الأهمية.
إن علاج MycAway™ من شركة Yeasen (1000×) عبارة عن مستحضر مضاد حيوي مختلط يحتوي على ثلاثة مكونات ذات تأثيرات مضادة للميكروبات على الميكوبلازما: الكينولونات ومشتقات التتراسيكلين والمضادات الحيوية من مجموعة الماكروليد. يحقق هذا الكاشف لإزالة الميكوبلازما تطهيرًا فعالًا للميكوبلازما عن طريق تثبيط تخليق الحمض النووي وإنتاج البروتينات الضرورية لنمو الميكوبلازما، دون الإضرار بالخلايا. كما يعمل على تعظيم إنقاذ الخلايا وتقليل الخسائر الناجمة عن تلوث الميكوبلازما.
مميزات المنتج
سمية منخفضة: سمية ضئيلة للخلايا، مما يضمن عدم التدخل في التجارب الخلوية اللاحقة مثل اختبارات النقل والقابلية للبقاء.
استقرار عالي: يمكن تخزين الكاشف لمدة طويلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مع الحفاظ على فعاليته العالية.
سهل الاستخدام: ببساطة قم بإضافة المنتج إلى وسط الثقافة الملوث بالميكوبلازما وقم بحضنه.
سريع المفعول: "نتائج فورية"، حيث تظهر التأثيرات بسرعة خلال 3 أيام.
طيف واسع: قادرة على إزالة غالبية أنواع الميكوبلازما الموجودة في المختبرات.
الشكل 6.توضيح لاختبار السمية الخلوية لمادة إزالة الميكوبلازما
الوقاية من الميكوبلازما
في عملية زراعة الخلايا، يحدث تلوث الميكوبلازما غالبًا. ومع ذلك، نظرًا لخصائصها الفريدة، من الصعب اكتشافها بالعين المجردة أو بالأجهزة المجهرية. لذلك، من المهم بشكل خاص القيام بعمل جيد في الوقاية من الميكوبلازما. يمكن تحقيق الوقاية الفعالة من تلوث الميكوبلازما عن طريق إضافة كواشف الوقاية من الميكوبلازما إلى وسط الثقافة.
في الوقت الحاضر، تنشأ الميكوبلازما في المختبرات بشكل رئيسي من: التلوث المتبادل بين الخلايا، وتلوث بيئة العمل أو معدات المختبر، وتقنيات التعقيم الرديئة من قبل المجربين، ووسائط الثقافة الملوثة أو الكواشف، والأنسجة أو الأعضاء الأصلية الملوثة بالميكوبلازما. تتميز سلسلة منتجات الوقاية من الميكوبلازما التي طورتها شركة Yeasen بالبساطة والراحة والاستقرار العالي، مما يجعلها مناسبة جدًا للوقاية من الميكوبلازما في مزارع الخلايا الروتينية.
معلومات المنتج
| منتج | رقم الكتالوج | اسم المنتج | مواصفات المنتج |
| عينة من مجموعة المعالجة الأولية | 18461ES | 25 طن/100 طن | |
| 18467ES | مجموعة تحضير العينات MolPure® Mag48 FN | 3×16 طن/ 6×16T | |
| جهاز استخلاص الأحماض النووية | 80511ES | جهاز استخلاص الأحماض النووية الآلي ذو 48 قناة | 48 قناة |
|
مجموعة الكشف عن الميكوبلازما | 40619ES |
| 25 طن/100 طن |
| 40612ES | مجموعة MycAway™ Plus-Color للكشف عن الميكوبلازما بخطوة واحدة | 25 طن/100 طن | |
| 40601ES | 10 اختبارات/20 اختبار | ||
| كاشف إزالة الميكوبلازما | 40607ES | مايكاوايالعلامة التجارية العلاج (1000×) - كاشف إزالة الميكوبلازما | 1مل/5×1مل
|
|
كاشف الوقاية من الميكوبلازما | 40608ES | مايكاوايالعلامة التجارية وقائي (2000×) - كاشف الوقاية من الميكوبلازما | 1مل/5×1مل
|
| 40605ES | مايكاوايالعلامة التجارية رش (جاهز للاستخدام) | 500 مل/2×500 مل/10×500 مل
| |
| 40609ES | مايك جاردالعلامة التجارية-1 محلول (100×) لتطهير حمام الماء لحاضنة ثاني أكسيد الكربون | 100مل | |
| 40610ES | مايك جاردالعلامة التجارية-2 محلول (500×) لتطهير حمام الماء العادي | 100مل |