في السنوات الأخيرة، ومع التطور السريع للطب الحيوي، وظهور العلاجات الخلوية والجينية في ظل جائحة كوفيد-19، وظهور لقاحات mRNA، أصبح ضمان سلامة وموثوقية المنتجات البيولوجية نقطة محورية للحكومات والهيئات التنظيمية في جميع أنحاء العالم. يعد تلوث الميكوبلازما نوعًا شائعًا من التلوث ولكنه عادة ما يكون صعبًا للقضاء عليه. تلزم المتطلبات التنظيمية "ضمان عدم تلوث الميكوبلازما" للعمليات الحيوية التي تنطوي على زراعة الخلايا.
متطلبات الهيئات التنظيمية لاختبار الميكوبلازما:
- تنص "إرشادات الصناعة: توصيف وتأهيل ركائز الخلايا والمواد البيولوجية الأخرى المستخدمة في إنتاج اللقاحات الفيروسية لمؤشرات الأمراض المعدية" الصادرة عن إدارة الغذاء والدواء على التحكم في الميكوبلازما في المواد الخام والبذور الفيروسية وسوائل الحصاد غير المعالجة.
- تتطلب طبعة عام 2020 من دستور الأدوية الصيني الجزء الثالث "إعداد ومراقبة جودة ركائز الخلايا الحيوانية المستخدمة في اختبار إنتاج المنتجات البيولوجية" اختبار الميكوبلازما لخلايا الإنتاج، بما في ذلك بنوك الخلايا الرئيسية (MCB)، وبنوك الخلايا العاملة (WCB)، وخلايا نهاية الإنتاج (EOPC).
- توصي "الإرشادات الفنية للبحث الصيدلاني وتقييم منتجات العلاج بالخلايا المناعية (التجربة)" بإجراء اختبارات تتعلق بسلامة الميكوبلازما على عينات وسيطة مناسبة في نقاط زمنية رئيسية أو تنفيذ التدابير ذات الصلة للسيطرة. كما أن اختبار الميكوبلازما مطلوب أيضًا كاختبار إطلاق للمنتجات النهائية.
اختبار الأحماض النووية (NAT) والطرق التقليدية:
قبل ظهور طرق الكشف السريع مثل تقنية تضخيم الأحماض النووية (NAT)، كانت طرق الثقافة التقليدية واختبارات الخلايا المؤشرة مستخدمة. ومع ذلك، نظرًا لدورات الكشف الطويلة أو مشكلات الحساسية، غالبًا ما كانت هذه الطرق تطيل دورات الإنتاج أو الإطلاق أو تتطلب إطلاقًا مشروطًا لمواد الخلايا بناءً على تقييم المخاطر أو استكشاف طرق بديلة. مع تقدم العلاجات الخلوية والجينية، هناك طلب متزايد داخل الصناعة على طرق الكشف عن الميكوبلازما ذات التوقيت والحساسية الأعلى. لا يمكن أن تتحمل مدة صلاحية المنتجات القصيرة فترات اختبار طويلة، وبالتالي ظهرت طرق تضخيم الأحماض النووية كبدائل مواتية.
حاليًا، أدرج دستور الأدوية الأوروبي (EP) <2.6.7>، ودستور الأدوية الياباني (JP)، ودستور الأدوية الأمريكي (USP) <63> جميعها طرق NAT كطرق للكشف عن الميكوبلازما. ومع ذلك، فإن التحقق من صحة هذه الطريقة ومقارنتها بالطرق التقليدية لضمان عدم انخفاض حساسيتها هي شروط أساسية لاستخدامها. على الرغم من أن طبعة عام 2020 من دستور الأدوية الصيني (ChP) لم تدرج NAT كطريقة للكشف عن الميكوبلازما، إلا أنها ذكرت إمكانية استخدام "طرق أخرى معترف بها من قبل هيئة تنظيم الأدوية الوطنية". في مايو 2022، أصدر مركز مراجعة الأدوية التابع للإدارة الوطنية للمنتجات الطبية (NMPA) "الإرشادات الفنية للبحث الصيدلاني وتقييم منتجات العلاج بالخلايا المناعية (التجربة)"، والتي تشير إلى النظر في تطوير طرق جديدة للكشف عن الميكوبلازما والمعقمة لاختبار الإطلاق في ظل ظروف خاصة عندما يكون حجم العينة محدودًا أو عندما تكون هناك حاجة للإطلاق السريع وطرق دستور الأدوية غير كافية. لذلك، من المتوقع أن يتم استخدام طرق NAT بشكل متزايد من قبل المزيد من موردي المواد الخام وشركات منتجات العلاج الطبي المتقدم (ATMP) كطريقة قادرة على دعم اختبار إطلاق الميكوبلازما السريع.
طريقة NAT - متطلبات التحقق من صحة الطريقة
تم وصف عملية التحقق من صحة طرق NAT بالتفصيل في دستور الأدوية الأوروبي <2.6.7> والأدوية اليابانية، مع كون محتواها متسقًا بشكل أساسي. كما نشرت المعاهد الوطنية لمراقبة الأغذية والأدوية (NIFDC) مقالاً بعنوان "اعتبارات حول طرق الكشف عن الأحماض النووية والتحقق المنهجي لفحص الميكوبلازما"، بهدف تقديم إرشادات للمطورين ومستخدمي طرق تضخيم الأحماض النووية للميكوبلازما في الصين. تعد الخصوصية وحد الكشف والمتانة ضرورية للتحقق من صحة طرق تضخيم الأحماض النووية للميكوبلازما. إذا تم استخدام مجموعات تجارية للكشف عن الميكوبلازما، فيمكن إجراء التحقق من ملاءمة الطريقة بناءً على تقرير أداء المجموعة الشامل للمورد، جنبًا إلى جنب مع بيئة المختبر ونوع العينة.
الخصوصية:
تشير الخصوصية إلى قدرة الطريقة التحليلية على تحديد المحلل بدقة في وجود مكونات أخرى (مثل الشوائب، ومنتجات التحلل، والمواد المساعدة، وما إلى ذلك). ويؤكد EP على الحاجة إلى التركيز على التفاعلات المتبادلة بين الأنواع البكتيرية الأخرى المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالشجرة التطورية، مثل Clostridium و Lactobacillus و Streptococcus داخل البكتيريا إيجابية الجرام. يجب أيضًا إيلاء الاهتمام لأنواع الملوثات الشائعة مثل تلوث الحمض النووي البشري في الخلايا المضيفة والبيئات التجريبية.
حد الإكتشاف:
حد الكشف هو أقل كمية من المحلل يمكن اكتشافها في العينة. وهو بمثابة أساس للتعريف النوعي ولا يحتاج إلى تحديده كقيمة دقيقة. يتطلب EP 24 نقطة بيانات للكشف لكل نوع من أنواع الميكوبلازما عند كل تركيز تخفيف. يمكن تحقيق ذلك من خلال إجراء ثلاث تخفيفات متسلسلة مستقلة بمقدار 10 أضعاف في أيام مختلفة، مع ثماني عمليات كشف متكررة لكل تدرج تخفيف، أو من خلال إجراء أربع تخفيفات متسلسلة مستقلة بمقدار 10 أضعاف في أيام مختلفة، مع ست عمليات كشف متكررة لكل تدرج تخفيف. يمكن اعتبار معدل إيجابية الكشف الذي يزيد عن 95٪ حد الكشف. بالنسبة لأنواع الميكوبلازما التي تتطلب تأكيد حد الكشف، يحتاج مصنعو الأدوات إلى تغطية أكبر عدد ممكن من أنواع الميكوبلازما حسب متطلبات دستور الأدوية التنظيمي واستكشاف حدود الكشف لكل نوع من أنواع الميكوبلازما. بالنسبة لشركات الأدوية الحيوية، فمن المستحسن النظر في أنواع الميكوبلازما البشرية أيضًا.
- إذا تم استخدام أو مواجهة خلايا أو مواد الطيور أثناء عملية الإنتاج، فيجب إجراء التحقق من حد الكشف عن Mycoplasma synoviae.
- إذا تم استخدام أو مواجهة مواد حشرية أو نباتية أثناء عملية الإنتاج، فيجب إجراء التحقق من حد الكشف عن بكتيريا الأكولبلازما.
- تعد ميكوبلازما الأنف الخنزيرية منتشرة بشكل كبير في العينات الملوثة بالميكوبلازما وقد جذبت انتباه معهد الصين لمراقبة الأغذية والأدوية.
وبالمقارنة مع دستور الأدوية الأوروبي، فإن دستور الأدوية الياباني لا يذكر الميكوبلازما الطيرية التي يتطلب التحقق من حد الكشف عنها، ولكنه يشمل الميكوبلازما اللعابية.
المتانة:
تشير المتانة إلى قدرة الطريقة على تحمل الاختلافات الصغيرة في ظروف القياس دون أن تتأثر، مما يوفر أساسًا لاستخدام الطريقة المعمول بها في الاختبارات الروتينية. يجب أن يركز تقييم المتانة على مدى تحمل طرق الكشف عن الميكوبلازما للاختلافات في تركيز MgCl2، والبادئات، وdNTPs في كواشف الكشف، والتغيرات في مجموعات استخلاص الأحماض النووية أو خطوات الاستخلاص، واستخدام مكبرات مختلفة للأحماض النووية.
دراسة المقارنة
إذا كان من المقرر استخدام NAT كبديل للطرق الدوائية، فمن الضروري التأكد من خلال المقارنة من أن NAT يمكن أن يحل محل الطرق القائمة على الثقافة أو طرق زراعة الخلايا المؤشرة.يتضمن هذا عادةً النظر في حد الكشف للطريقة، فضلاً عن الخصوصية (مثل نطاق تغطية الميكوبلازما والإيجابيات الكاذبة المحتملة). لمقارنة حدود الكشف، يجب أن تفي بالمعايير التي تنص على أن "حد الكشف البالغ 10 وحدات تشكيل مستعمرة/مل يمكن أن يحل محل الأساليب القائمة على الثقافة، وأن حد الكشف البالغ 100 وحدة تشكيل مستعمرة/مل يمكن أن يحل محل أساليب زراعة الخلايا المؤشرة".
هناك طريقتان اختياريتان لإجراء دراسات المقارنة:
- إجراء تجارب متزامنة باستخدام نفس سلالات الميكوبلازما المعتمدة لكل من طرق NAT والطرق الدوائية لتأكيد حد الكشف.
- مقارنة نتائج التحقق من صحة NAT مع نتائج التحقق من صحة الطريقة الدستورية السابقة، ولكن هناك حاجة إلى توثيق دقيق لملفات التأكيد لمعايير الميكوبلازما المستخدمة في كلتا الطريقتين.
الكشف عن الميكوبلازما NAT qPCR - الحل الشامل
المنتجات ذات الصلة
مجموعة اختبار MycAway™ Mycoplasma qPCR (طريقة الفحص) من Yeasen هي منتج سريع للكشف النوعي يعتمد على تقنيات تضخيم الأحماض النووية (NAT) للكشف عن التلوث المحتمل بالميكوبلازما في المواد الخام وبنوك الخلايا والبذور الفيروسية وسوائل حصاد الفيروسات أو الخلايا والخلايا العلاجية. تستخدم هذه المجموعة، التي تعتمد على تقنية PCR الكمية، مجسات فلورية Taqman للكشف النوعي عن الحمض النووي للميكوبلازما في عينة الاختبار، وتغطي أكثر من 160 تسلسلًا من الحمض النووي للميكوبلازما. وهي تتبع بدقة إرشادات ومتطلبات EP 2.6.7 وJP G3 للكشف عن الميكوبلازما، مما يدل على حساسية عالية وخصوصية جيدة وسلامة. يمكن استخدامها جنبًا إلى جنب مع مجموعة معالجة عينات الحمض النووي المتبقية من MolPure® Magnetic Bead لاستخراج العينات يدويًا أو استخراج الأحماض النووية تلقائيًا باستخدام مستخلص الأحماض النووية الأوتوماتيكي بالكامل Auto-Pure 32A. بعد معالجة العينة مسبقًا لإزالة الشوائب المتداخلة والحصول على الحمض النووي للميكوبلازما النقي، يتم جمع إشارة الفلورسنت للمسبار من خلال qPCR لتحديد نتيجة الكشف.
الخدمات الفنية
- توفير تقارير التحقق الشاملة لمجموعة اختبار MycAway™ Mycoplasma qPCR.
- توفير الخدمات الفنية للتحقق من إمكانية تطبيق العينات على العملاء.
- توفير الدعم للتدقيق.
| وصف | رقم القطعة |
| 18461ES | |
| مجموعة الكشف عن الميكوبلازما qPCR من MycAway™ (2جي) | 40619ES |