Deoxyribonuclease I (DNase I) er en endonuklease, dens anvendelse er ikke kun til at opretholde RNA-integritet, men også til DNA-fodaftryksanalyse, generering af tilfældige DNA-biblioteker, reduktion af klæbrighed i cellelysater eller proteinekstrakter osv. Kort sagt, DNase I kan bruges i næsten enhver applikation, der kræver enzymspaltning af DNA. Det følgende er en detaljeret introduktion til DNase I og dets specifikke anvendelse.

1. Hvad er DNase I?
2. DNase I til fremstilling af DNA-fri RNA-ekstraktion
3. DNase I til in vitro-transkription for at fjerne template-DNA
4. DNase I til rRNA-fjernelse
5. DNase I til DNA-mærkning
6. Andre anvendelser
7. DNase I produktvalgsguide

1. Hvad er DNase I?

Deoxyribonuklease I (DNase I) er en uspecifik endonuklease, der kan fordøje enkelt- eller dobbeltstrenget DNA, som findes i forskellige væv og kropsvæsker. Det kan hydrolysere phosphodiesterbindinger for at producere mono- og oligodeoxynukleotider, der indeholder en 5'-phosphatgruppe og en 3'-OH-gruppe. Det optimale arbejds-pH-område for DNase I er 7-8, dets aktivitet afhænger af Ca2+ og kan aktiveres af divalente metalioner såsom Mn2+, Mg2+, Zn2+ osv. I nærvær af Mg2+ forskyder DNase I tilfældigt ethvert sted af dobbeltstrenget DNA; i nærvær af Mn2+ kan DNase I forskyde DNA dobbeltstrenget på det samme sted for at danne en stump ende eller en 1-2 nukleotid klæbrige ender udhænger.

Figur 1. Skematisk diagram af spaltningen af ​​dsDNA med DNase I i nærvær af Mg2+ og Mn2+.

Selvom DNase I-spaltninger generelt anses for at være ikke-specifikke spaltninger, er det mere sandsynligt, at DNase I virker på visse sekvensfragmenter, såsom minor groove-regionen, og er mere tilbøjelig til spaltninger af purin-pyrimidinsekvenser. Men når DNase I virker på heterogent dsDNA, vil alle fire baser blive spaltet, og virkningen på en specifik base vil ikke være mere end 3 gange større end andre basers.

2. DNase I til fremstilling af DNA-fri RNA-ekstraktion

I biologiske eksperimenter er det første trin at forberede nukleinsyre til at studere forskellige funktioner af RNA. Men da DNA og RNA ofte frigives sammen under cellelyseprocessen, kan interferensen i de to ikke undgås, uanset hvilken ekstraktionsopløsning der bruges, så specifikke enzymer skal bruges til at fjerne interferensen. Til højkvalitets RNA-ekstraktion bruges DNase I til at fjerne resterende DNA fra prøven.

DNase I kan nedbryde dobbeltstrenget og enkeltstrenget DNA til oligonukleotider og enkelte nukleotider, og DNA'et i RNA-præparationsproduktet kan effektivt nedbrydes. DNase I inaktiveres derefter ved opvarmning med en stopbuffer. Under opvarmningsprocessen kan hårnålestrukturen af ​​RNA-molekylet åbnes, hvilket letter RNA'ets direkte indtræden i omvendt transkriptionsprocessen.
Kvaliteten af ​​RNA vil direkte påvirke de eksperimentelle data i høj grad. Generelt kan gDNA-rester ikke fuldstændigt undgås under RNA-ekstraktion, derfor anbefales det generelt at behandle RNA-prøver med DNase I for at fordøje resterende gDNA, før man udfordrer nedstrømsapplikationer (f.eks. mRNA-ekspressionsanalyse, transkriptomanalyse osv.). Trinnet med at fordøje gDNA kan udføres under RNA-ekstraktion, efter RNA-ekstraktion eller før RNA-revers transkription.I henhold til produktpositioneringen er produkterne leveret af Yeasen som følger:

Tabel 1: Liste over produkter relateret til DNA-fjernelse af RNA-ekstraktion eller før revers transkription

3. DNase I til in vitro-transkription for at fjerne template-DNA

In vitro transkription (IVT) bruger hovedsageligt DNA som skabelon plus tilsvarende substrater og buffere til at opnå RNA gennem in vitro transkription. I in vitro-transkriptionseksperimenter bruges RNA-polymeraser såsom T7, T3 og SP6 almindeligvis til RNA-syntese. Det syntetiserede RNA kan have DNA-rester. Eliminering af DNA-resterne er gavnligt for udviklingen af ​​downstream-eksperimenter. For eksempel i mRNA-vaccineudviklingsstadiet er fjernelse af rester et kritisk trin, som kan reducere vanskeligheden ved nedstrøms oprensning og øge produktets renhed. DNA-skabelonen fjernes typisk under anvendelse af rekombinant DNase I (RNase-fri).Ifølge mRNA-synteseprocessen er produkterne leveret af Yeasen som følger: