T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimerer transkriptionsreaktionssystemet. Sættet kan syntetisere det enkeltstrengede RNA effektivt ved at bruge T7 RNA-polymerase, det lineære dobbeltstrengede DNA med T7-promotorsekvensen som skabelonen og NTP'er som substratet til at kontrollere DNA-sekvensen nedstrøms for promotoren. Under transkription kan modificerede nukleotider tilføjes til substratet for at fremstille biotin eller farvestof-mærket RNA.

1. Introduktion af T7 High Yield RNA Synthesis Kit
2. Principper for in vitro transskription
3. Fordele ved Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit
4. Produktets ydeevne
5. Sådan bruger du dette sæt
6. Ofte stillede spørgsmål
7. Bestillingsoplysninger

1. Introduktion af T7 High Yield RNA Synthesis Kit

T7 High Yield RNA Synthesis Kit kan syntetisere både lange transkripter og korte transkripter, og RNA kan produceres 100-200 μg med 1 μg DNA skabelon input. Det syntetiserede RNA kan bruges til forskellige downstream-applikationer, såsom RNA-struktur- og funktionsforskning, RNase-beskyttelse, probehybridisering, RNA-interferens, mikroinjektion og in vitro oversættelse.

2. Principper for in vitro transskription

Figur 1. In vitro transskriptionsproces

3. Fordele ved Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit

Ekstremt høje udbytter - op til 200 µg på 2 timer
Alsidig – velegnet til 20nt-10000nt RNA-transkripter
Multiple anvendelser – genererer umærket, mærket eller afgrænset RNA

4. Produktets ydeevne

Figur 2. IVT-udbyttesammenligning

Bemærk: Alle reaktionsreagenser er fra T7 RNA-syntesesæt (Yeasen#10623 eller B*-firma). IVT-reaktionsudbytterne for Yeasen og B*-firmaet er vist ovenfor.

Figur 3. Kvaliteten af ​​transkriptionelle produkter i forskellige længder

Figur 4. Ekspressionsniveauet af det transskriberede mRNA i HEK-293-celler

Bemærk: mRNA'et er lukket med Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615)

5. Sådan bruges dette sæt

5.1 Optøningsreagenser

Centrifuger T7 RNA Polymerase Mix kort og anbring på is. Optø 10 x transkriptionsbuffer og ribonukleotider (ATP, CTP, GTP, UTP), bland og centrifuger til bunden af ​​røret, anbring 10 x transkriptionsbuffer ved stuetemperatur og anbring fire typer ribonukleotider på is.

5.2 Forbered transkriptionsreaktionssystemet i henhold til følgende tabel

Tabel 1.Fremstillingsmetode for transkriptionsreaktionssystemet

Note:
a) Reaktionen fremstilles ved stuetemperatur. Da 10× transkriptionsbufferen indeholder spermidin, vil koncentrationen af ​​spermidin for høj ved lave temperaturer forårsage DNA-skabelonudfældning.
b) Kort transkript (<100 nt), 2 µg skabelon kan anvendes, transkriptionstid øget til 4-8 timer.
c) For lange transkripter (>1000 nt) anbefales de lineariserede plasmidskabeloner til transkription.
d) Udfør reaktionen i PCR-maskinen med det varme låg åbent for at forhindre reaktionsopløsningen i at fordampe i lang tid.
e) Reaktionsproduktet kan have et hvidt bundfald. Dette er magnesiumpyrophosphat dannet af frit pyrophosphat og magnesiumioner under reaktionen, hvilket ikke vil påvirke de efterfølgende eksperimenter. Du kan tilføje EDTA for at fjerne det. Hvis du er bekymret for tilsætning af EDTA påvirker efterfølgende eksperimenter, kan supernatanten også genvindes ved centrifugering.
f) Reagenserne og beholderne bør være uden RNase-kontamination.

5.3 Inkuber ved 37°C i 2 timer

Bland ovenstående reaktionsopløsning, centrifuger kortvarigt til bunden af ​​røret, og inkuber ved 37°C i 2 timer. Hvis transkriptets længde er mindre end 100 nt, øges reaktionstiden til 4-8 timer.

5.4 DNase I-behandling (valgfrit)

Når reaktionen er afsluttet, tilsættes 2 μL DNase I (RNase-fri) til hvert rør og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter for at fjerne skabelon-DNA'et.

6. Ofte stillede spørgsmål

6.1 Udbyttet af IVT-reaktionen er lavt

Skabelonkvaliteten er tæt forbundet med udbyttet. Hvis udbyttet af forsøgsgruppen er væsentligt lavere end for den positive kontrolgruppe, kan de mulige årsager være.
① Skabelonerne indeholder komponenter, der vil hæmme IVT-reaktion.
② Der er noget galt med skabeloner.

6.2 Forslag

① Rens skabelonen igen.
② Bekræft skabelonernes koncentration og integritet.
③ Forlæng reaktionstiden.
④ Forøg skabelonens input.
⑤Prøv andre RNA-polymeraser og tilsvarende promotorer.

6.3 Udbyttet af korte afskrifter er lavt

Hvis måltranskripterne er kortere end 100 nt, forlænges reaktionstiden til 4-8 timer eller øges input af skabeloner til 2ug i et 20 μL reaktionssystem.

6.4 Der er uventede længere udskrifter

Hvis resultatet af gelelektroforese viser, at der er uventede længere transkriptioner, kan de mulige årsager være:
① Plasmidskabeloner er muligvis ikke fuldt lineariserede.
②Skabeloner har sammenhængende ender med 3' udhæng.
③Afskrifter har en sekundær struktur, der ikke er fuldstændig denatureret.

6.5 Forslag

①Tjek, om plasmidskabeloner er fuldt lineariserede. Udfør om nødvendigt plasmidlinearisering igen.
②Vælg passende restriktionsenzymer for at linearisere plasmidskabeloner og undgå at producere sammenhængende ender med 3'-udhæng. Det er praktisk muligt at bruge Klenow-fragment eller T4 DNA-polymerase til at producere en stump ende, hvis det er nødvendigt.
③Brug denatureret gel til at detektere transkriptioner.

6.6 Der er uventede kortere udskrifter

Hvis resultatet af gelelektroforese viser, at der er uventede kortere transkriptioner, kan de mulige årsager være:
①Der er en sekvens analog med termineringssekvensen for T7 RNA-polymerase i skabeloner.
②GC-indholdet i skabeloner er højt.

6.7 Forslag

①Sænk reaktionstemperaturen (såsom 30 ℃), men bemærk, at sænkning af reaktionstemperaturen nogle gange vil reducere udbyttet.
②Prøv andre RNA-polymeraser for at katalysere IVT-reaktion.
③Hvis GC-indholdet i skabeloner er højt, skal du indstille IVT-reaktionstemperaturen til 42 ℃ eller tilføje SSB til IVT-reaktionssystemet for at øge udbyttet og længden af ​​transkriptioner.

6.8 Der er udtværing af transkripter under gelelektroforese

Hvis der er udtværing af transskriptioner under gelelektroforese, kan de mulige årsager være:
①Der er RNase-kontamination under eksperimentel drift.
②DNA-skabeloner er kontamineret med RNaser.

6.9 Forslag

①Sørg for, at alle reagenser er formuleret med RNase-fri H2O. Brug RNase-fri pipettespidser og Eppendorf-rør, og brug latex-engangshandsker og -masker under eksperimentel drift.
②Genrens DNA-skabeloner.

7. Bestillingsoplysninger

Følgende er repræsentative produkter, der tilbydes af Yeasen. Yderligere størrelser er tilgængelige. Vores produkter er yderst optimeret til at fungere sammen, for at sikre overlegen ydeevne og reproducerbarhed.
Vi kan også levere skræddersyede tjenester. Hvis du er interesseret i et produkt, der ikke er vist, så kontakt os, og vi vil arbejde sammen med dig for at opfylde dine behov.

Tabel 2.Produktinformation

Angående læsning:

GMP-grade reagenser til mRNA in vitro syntese

Yeasen Bioteknologi GMP Grade mRNA In Vitro Syntese Råmaterialer